[發(fā)明專利]檢測結(jié)直腸癌患者外周血循環(huán)腫瘤細胞E-Cadherin表達的免疫熒光試劑盒

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• 申請日: 2020-07-01
• 公開（公告）號: CN111965363A
• 公開（公告）日: 2020-11-20
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李琛琛;洪瑛;侯景陽;李文濤
• 申請（專利權(quán)）人: 山東凱歌智能機器有限公司
• 主分類號: G01N33/58
• 分類號: G01N33/58;G01N33/574;G01N33/569;B01D29/05
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本發(fā)明提供一種結(jié)直腸癌患者外周血循環(huán)腫瘤細胞E?Cadherin基因表達的免疫熒光試劑盒及檢測方法，屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體的，試劑盒主要包括：山羊血清，小鼠抗CK、大鼠抗CD45和兔抗E?Cadherin組成的一抗混懸液，熒光標(biāo)記的羊抗小鼠、熒光標(biāo)記的羊抗大鼠、熒光標(biāo)記的羊抗兔組成的二抗混懸液。檢測方法主要包括采集外周血，處理外周血，過濾富集循環(huán)腫瘤細胞，免疫熒光方法檢測循環(huán)腫瘤細胞E?Cadherin基因表達情況。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明提供了一種結(jié)直腸癌患者外周血循環(huán)腫瘤細胞E-Cadherin表達的免疫熒光試劑盒及檢測方法，屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

結(jié)直腸癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，2018年死亡率居惡性腫瘤第四位。在美國，結(jié)直腸癌是第三大最常見的惡性腫瘤。在國內(nèi)，2018年中國全年流行病學(xué)數(shù)據(jù)：結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率均為第5位，年新發(fā)病例37.63萬，25％被確診時已發(fā)生轉(zhuǎn)移。結(jié)直腸癌早期多無癥狀，出現(xiàn)癥狀時多為中晚期且有轉(zhuǎn)移。盡管外科手術(shù)和化療方案不斷革新，進展期結(jié)直腸癌患者的生存率依舊很差。由于結(jié)直腸癌尚缺乏較好的預(yù)防方法，所以改善結(jié)直腸癌預(yù)后并提高生存率的最有效的措施就是早期診斷并治療結(jié)直腸早期癌及癌前病變。

E-鈣粘蛋白(E—Cadherin)是上皮細胞表型最經(jīng)典的標(biāo)志物，E-Cadherin表達的下調(diào)標(biāo)志著細胞之間粘附能力的下降，因此E-Cadherin被當(dāng)做鑒定結(jié)直腸癌EMT發(fā)生的主要手段之一，作為一類細胞表面糖蛋白，E-Cadherein在細胞-細胞之間的粘附中發(fā)揮重要作用，并參與組織器官形態(tài)的維持。近年來有關(guān)于結(jié)直腸癌EMT和腫瘤耐藥之間的關(guān)系日益受到重視，大量研究顯示在不同的腫瘤當(dāng)中由于EMT的發(fā)生而同時耐藥性的升高，并且都伴隨著E-Cadherin表達的改變。目前臨床實踐中，結(jié)直腸癌患者E-Cadherin檢測的標(biāo)本主要為腫瘤組織，來源于手術(shù)或穿刺活檢，很難做到多次或?qū)崟r檢測。

循環(huán)腫瘤細胞（Circulating tumor cell，CTC）是從實體腫瘤脫落進入外周血液循環(huán)的腫瘤細胞，自1989年被發(fā)現(xiàn)以來，目前已有多種方法用于外周血循環(huán)腫瘤細胞的檢測。近期研究表明，其檢測對于評估腫瘤患者尤其是晚期腫瘤患者的預(yù)后以及選擇合適的個體化治療具有重要的臨床意義。因CTC檢測具有微創(chuàng)、實時檢測等特點，被稱為腫瘤的“液態(tài)活檢”。

免疫熒光分析技術(shù)即將免疫學(xué)方法(抗原抗體特異結(jié)合)與熒光標(biāo)記技術(shù)結(jié)合起來用以研究特異蛋白抗原在細胞內(nèi)分布的方法。由于熒光素所發(fā)出的熒光可在熒光顯微鏡下檢出，熒光素受激發(fā)光的照射而發(fā)出明亮的熒光(黃綠色或橘紅色)，可以看見熒光所在的細胞或組織，利用定量技術(shù)測定含量，從而對抗原進行細胞定性和定位分析。

針對目前臨床實踐中，結(jié)直腸癌患者E-Cadherin檢測的標(biāo)本主要為腫瘤組織，來源于手術(shù)或穿刺活檢，很難做到多次或?qū)崟r檢測。因此，檢測循環(huán)腫瘤細胞(CTC) E-Cadherin表達情況對結(jié)直腸癌預(yù)后及免疫治療療效評估具有重要價值。

發(fā)明內(nèi)容

針對現(xiàn)有技術(shù)中的檢測腫瘤晚期或復(fù)發(fā)結(jié)直腸癌患者無法實時或反復(fù)穿刺獲取組織標(biāo)本、進而不能評估患者E-Cadherin實時動態(tài)狀態(tài)，及現(xiàn)有檢測方法容易出現(xiàn)假陽性和假陰性的缺點，本發(fā)明提供了一種結(jié)直腸癌患者外周血循環(huán)腫瘤細胞E-Cadherin表達的免疫熒光試劑盒及檢測方法，利用膜過濾裝置分離獲得晚期結(jié)直腸癌患者外周血中的循環(huán)腫瘤細胞（CTC），進一步運用免疫熒光技術(shù)檢測CTC上E-Cadherin表達情況。

本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：

一種檢測結(jié)直腸癌患者外周血循環(huán)腫瘤細胞E-Cadherin表達的免疫熒光試劑盒，包括稀釋液45mL，脫色液1mL，染色液A 0.5mL，染色液B 1mL，200μl 甲醇、200μl 2%PFA，100μl10%山羊血清，小鼠抗CK、大鼠抗CD45和兔抗E-Cadherin組成的一抗混懸液100μl，熒光標(biāo)記的羊抗小鼠、熒光標(biāo)記的羊抗大鼠、熒光標(biāo)記的羊抗兔組成的二抗混懸液100μL，DAPI封片劑；