[發(fā)明專利]透明顫菌血紅蛋白在提高頭孢菌素C酰化酶表達量中的應(yīng)用

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202010618485.6
• 申請日: 2020-06-30
• 公開（公告）號: CN111849946A
• 公開（公告）日: 2020-10-30
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 余少文;李星;謝寧
• 申請（專利權(quán)）人: 深圳大學(xué)
• 主分類號: C12N9/80
• 分類號: C12N9/80;C12N15/31;C12N15/55;C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 深圳市德錦知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44352
• 代理人: 黃萍

本發(fā)明涉及透明顫菌血紅蛋白在提高頭孢菌素C酰化酶表達量中的應(yīng)用，公開了一種提高頭孢菌素C酰化酶表達量的方法，所述方法包含頭孢菌素C酰化酶基因和透明顫菌血紅蛋白基因在大腸桿菌中共表達的步驟。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種透明顫菌血紅蛋白在提高頭孢菌素 C酰化酶表達量中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

頭孢菌素是世界上使用較為廣泛的半合成抗生素，在臨床使用中,多數(shù)頭孢類抗生素生產(chǎn)的中間體為7-氨基頭孢烷酸。7-氨基頭孢烷酸主要來自頭孢菌素C 脫酰作用，主要脫酰方式有化學(xué)法、二步酶法和一步酶法。化學(xué)脫酰法具有環(huán)境不友好且反應(yīng)條件苛刻等缺點已經(jīng)被市場淘汰。二步酶法已經(jīng)基本應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，但二步酶法轉(zhuǎn)化率低，反應(yīng)不易于控制。一步酶法可以直接將頭孢菌素C 脫酰轉(zhuǎn)化為7-氨基頭孢烷酸，具有高轉(zhuǎn)化率、高經(jīng)濟性和環(huán)境友好性等優(yōu)點受到了廣泛研究。

透明顫菌血紅蛋白發(fā)現(xiàn)于透明顫菌體內(nèi)，屬于貝日阿托菌屬，專性好氧革蘭氏陰性絲狀菌。透明顫菌血紅蛋白與血紅蛋白在光譜學(xué)和氧結(jié)合動力學(xué)上相似，是人類首次發(fā)現(xiàn)的微生物血紅蛋白。透明顫菌血紅蛋白可以在很多宿主細胞中表達，通過促進氧的輸送增強呼吸和能量代謝，以提高許多有用的代謝產(chǎn)物，如抗生素、蛋白質(zhì)、聚合物等的產(chǎn)量和宿主抗逆性，還能降低有害化合物的毒害作用。

由于大自然中存在的頭孢菌素C酰化酶活性較低且不穩(wěn)定，難于工業(yè)應(yīng)用，因此獲得一種具有高轉(zhuǎn)化效率的頭孢菌素C酰化酶成為解決問題的關(guān)鍵。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種提高頭孢菌素C酰化酶表達量的方法，所述方法包含頭孢菌素C酰化酶基因和透明顫菌血紅蛋白基因在大腸桿菌中共表達的步驟。

具體步驟如下：

(1)分別擴增頭孢菌素C酰化酶基因和透明顫菌血紅蛋白基因；

(2)以步驟1獲得的兩種基因構(gòu)建大腸桿菌共表達載體并轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌獲得重組菌株；

(3)培養(yǎng)并誘導(dǎo)重組菌株表達頭孢菌素C酰化酶；

(4)優(yōu)化培養(yǎng)條件提高重組菌株表達頭孢菌素C酰化酶的酶活。

進一步地，所述大腸桿菌為ptsG基因缺失的大腸桿菌。

本發(fā)明的另一個目的是提供頭孢菌素C酰化酶基因和透明顫菌血紅蛋白基因的共表達在提高頭孢菌素C酰化酶表達中的應(yīng)用。

進一步地，所述大腸桿菌為ptsG基因缺失的大腸桿菌。

本發(fā)明的再一個目的是通過培養(yǎng)基優(yōu)化提高頭孢菌素C酰化酶在大腸桿菌中的表達。

附圖說明

圖1是頭孢菌素C酰化酶基因PCR擴增電泳圖，其中，第一泳道是M maker，第2-5泳道是CA條帶。

圖2是透明顫菌血紅蛋白vgb基因PCR電泳擴增圖，其中第一泳道是M maker，第2泳道是vgb條帶。

圖3是表達載體pETDuet-CA的構(gòu)建圖。

圖4是表達載體pETDuet-Vgb的構(gòu)建圖。

圖5是表達載體pET28α-CA-Vgb的構(gòu)建圖。

圖6是重組菌株pETDuet-CA/pRSFDuet-vgb(ptsG⁽⁺⁾BL21(DE3))菌落PCR驗證圖。其中，左起第1泳道為M maker，第2-11泳道分別為相同的重組菌株。泳道2、4、6、8、10為頭孢菌素C酰化酶PCR驗證，泳道3、5、7、9、11為透明顫菌血紅蛋白PCR驗證。