[發(fā)明專利]腎細胞癌患者外周血循環(huán)腫瘤細胞E-Cadherin表達的免疫熒光試劑盒及檢測方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202010617708.7
• 申請日: 2020-07-01
• 公開（公告）號: CN111679077A
• 公開（公告）日: 2020-09-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李琛琛;洪英;侯景陽;李文濤
• 申請（專利權(quán)）人: 山東凱歌智能機器有限公司
• 主分類號: G01N33/58
• 分類號: G01N33/58;G01N33/574;G01N33/569;B01D29/05
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種檢測腎細胞癌患者外周血循環(huán)腫瘤細胞E-Cadherin基因突變的試劑盒，其特征在于，包括稀釋液45mL，脫色液1mL，染色液A 0.5mL，染色液B 1mL，200μl 甲醇、200μl 2%PFA，100μl10%山羊血清，小鼠抗CK、大鼠抗CD45和兔抗E-Cadherin組成的一抗混懸液100μl，熒光標(biāo)記的羊抗小鼠、熒光標(biāo)記的羊抗大鼠、熒光標(biāo)記的羊抗兔組成的二抗混懸液100μL，DAPI封片劑；

一抗混懸液中小鼠抗CK、大鼠抗CD45和兔抗E-Cadherin分別按1:100、1:400和1:500稀釋，總體積為100μL；

二抗混懸液中熒光標(biāo)記的羊抗小鼠、熒光標(biāo)記的羊抗大鼠、熒光標(biāo)記的羊抗兔按1:500稀釋。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述稀釋液是由1mmol/L EDTA+0.1%BSA+0.1%海藻糖+0.2%月桂醇聚氧乙烯醚組成。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述脫色液是由95%酒精與100%二甲苯按容積比1:1組成。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述染色液A為DAB染色液；所述染色液B為蘇木素染色液。

5.一種權(quán)利要求1-4任一項所述試劑盒非診斷目的檢測腎細胞癌患者外周血循環(huán)腫瘤細胞E-Cadherin表達的方法，包括以下步驟：

（1）利用膜過濾裝置分離獲取無法獲得組織標(biāo)本的晚期或復(fù)發(fā)腎細胞癌患者外周血：采集無法獲取組織標(biāo)本的晚期或復(fù)發(fā)腎細胞癌患者肘正中靜脈外周血5ml；

（2）外周血樣預(yù)處理：將采集的外周血樣采用稀釋液進行10倍稀釋，稀釋后加多聚甲醛固定外周血樣10分鐘，固定終濃度為0.25%；

（3）利用膜過濾分離腫瘤細胞裝置過濾外周血樣，分離獲得外周血CTC：將預(yù)處理的外周血樣加入到膜過濾分離腫瘤細胞裝置的血樣容器中，使其依靠重力自然過濾；

（4）過濾結(jié)束后，從膜過濾分離腫瘤細胞裝置中取下濾器，將循環(huán)腫瘤細胞染色液A液0.5ml加入到濾器中，染色3min，PBS緩沖液沖洗干凈；濾液過濾完全后加入染色液B液1ml，染色2min，純水1ml沖洗2次；

（5）向濾器中加入200μl 2%PFA，室溫固定5min，完成后0.5ml PBS漂洗3次，每次2min；

（6）再向濾器中加入200μl預(yù)冷的甲醇，4℃固定15min，取下濾膜，放置在載玻片上，干燥后在顯微鏡下觀察，確定是否存在CTC；

（7）運用免疫熒光方法檢測外周血CTC的E-Cadherin表達情況。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測方法，其特征在于，步驟（7）所述檢測外周血CTC的E-Cadherin表達的具體方法如下：

（1）脫色：將帶有CTC的濾膜從載玻片上取下，置于脫色液中浸泡4-6小時，脫去CTC染色液，PBS洗2min×3次；

（2）封閉：向濾膜上滴加100μl 10%山羊血清，室溫放置30min，完成后吸去多余的血清（注：羊血清用PBS稀釋）；

（3） 一抗孵育：向濾膜上滴加100μl小鼠抗CK、大鼠抗CD45和兔抗E-Cadherin組成的一抗混懸液，37℃孵育1h或4℃過夜，完成后PBS洗3min×3次；

（4）二抗孵育：向濾膜上滴加100μl熒光標(biāo)記的羊抗小鼠、熒光標(biāo)記的羊抗大鼠、熒光標(biāo)記的羊抗兔組成的二抗混懸液，室溫孵育30min，完成后PBS洗2min×3次；

（5）使用含DAPI的封片劑封片，閱片，采圖；

（6）采圖完成后，脫片后進行瑞氏吉姆薩染色，與IF結(jié)果進行對比。