[發(fā)明專利]一種小菜蛾胰蛋白酶Trypsin-9基因及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010614484.4
• 申請(qǐng)日: 2020-06-30
• 公開（公告）號(hào): CN111778267B
• 公開（公告）日: 2023-02-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 金豐良;許小霞;花艷艷;李樹忠
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/57
• 分類號(hào): C12N15/57;C12N9/76;C12N15/70;C12N1/21;A01N63/50;A01N63/23;A01P7/04;C12R1/19
• 代理公司: 廣州粵高專利商標(biāo)代理有限公司 44102
• 代理人: 趙崇楊

本發(fā)明公開了一種小菜蛾胰蛋白酶Trypsin?9基因及其應(yīng)用，所述小菜蛾胰蛋白酶Trypsin?9基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。本發(fā)明研究表明Trypsin?9在小菜蛾中腸對(duì)Cry1Ac原毒素的活化起著重要的作用，添食Trypsin?9可以顯著提高小菜蛾中腸液Bt Cry1Ac原毒素的活化，小菜蛾死亡率顯著升高；而沉默小菜蛾Trypsin?9基因在中腸中的表達(dá)后，會(huì)降低了小菜蛾中腸對(duì)食物的消化，導(dǎo)致化蛹畸形，表明Trypsin?9可以作為新型生物防治的分子靶標(biāo)，用于十字花科蔬菜害蟲的防控，具有很好的生物防治潛力和應(yīng)用前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，一種小菜蛾胰蛋白酶Trypsin-9 基因及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

胰蛋白酶(Trypsin)屬于絲氨酸蛋白酶家族，以酶原前體(Pre-trypsinogen) 形式在動(dòng)物胰臟產(chǎn)生，是脊椎動(dòng)物消化道中一種主要的蛋白水解酶，去掉信號(hào)肽變成胰蛋白酶原，后經(jīng)腸腔由腸激酶激活而生成有活性的胰蛋白酶，其功能主要是消化食物中蛋白質(zhì)；激活其他酶原如(糜蛋白酶原、梭膚酶原、彈性蛋白酶原)。

昆蟲胰蛋白酶由中腸腸壁細(xì)胞產(chǎn)生分泌進(jìn)人中腸，主要在取食期的幼蟲中腸中被檢測到，是昆蟲堿性中腸環(huán)境中主要的一種絲氨酸蛋白酶，在蛋白的消化和 Bt毒素的毒性調(diào)節(jié)中起重要作用。其分泌及激活機(jī)制尚未十分明確，故多將其稱為胰蛋白酶樣酶(Trypsin-Like proteinase)，但具有與脊推動(dòng)物胰蛋白酶相同的活性位點(diǎn)及特異性作用底物。一般來說，昆蟲胰蛋白酶原的長度為256個(gè)氨基酸，有活性的胰蛋白酶的長度為232個(gè)氨基酸，昆蟲胰蛋白酶是絲氨酸蛋白酶家族，所以它具有絲氨酸蛋白酶的保守序列：a：活性位點(diǎn)含有在所有絲氧酸蛋白酶中都保守的His、Asp和Ser催化三聯(lián)體區(qū)域來激活其他酶原(GDSGGP和TAAHC)； b：底物結(jié)合位點(diǎn)Asp¹⁸²(在不同昆蟲中位置稍有不同)也是保守的，通過電荷作用而定底物裂解位點(diǎn)的或殘基。c：胰蛋白酶N末端的氨基酸序列為 Ile-Val-Gly-Gly。d：昆蟲胰蛋白酶的二硫鍵為3個(gè)。隨著基因克隆技術(shù)的飛速發(fā)展，胰蛋白酶的分子生物學(xué)研究進(jìn)入了一個(gè)新的階段。很多昆蟲如(果蠅 Drosophila melanogaster、家蠶Bombyxmori、埃及伊蚊Aedes aegypti、煙草天蛾 Manduca sexta和美國牧草盲蝽Lyguslineolaris)胰蛋白酶被克隆，并對(duì)其序列進(jìn)行了詳盡的研究。但是目前有關(guān)于小菜蛾胰蛋白酶相關(guān)基因還鮮有報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述缺陷和不足，提供一種小菜蛾胰蛋白酶Trypsin-9基因。

本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供一種小菜蛾胰蛋白酶Trypsin-9蛋白。

本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供所述Trypsin-9基因和胰蛋白酶Trypsin-9的應(yīng)用。

本發(fā)明的上述目的是通過以下技術(shù)方案給予實(shí)現(xiàn)的：

本發(fā)明首先從小菜蛾中腸中克隆得到了一種小菜蛾胰蛋白酶Trypsin-9基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，序列大小為820bp。其所編碼的小菜蛾胰蛋白酶Trypsin-9，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，序列長度為258aa。

本發(fā)明還提供含有Trypsin-9基因的重組表達(dá)載體。

優(yōu)選地，所述重組表載體中含有去除Trypsin-9基因信號(hào)肽之后的序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

優(yōu)選地，所述重組表達(dá)載體為pET-32a-Trypsin-9，用于表達(dá)重組蛋白 Trypsin-9。

本發(fā)明還提供抑制Trypsin-9表達(dá)的RNAi載體。

優(yōu)選地，所述RNAi載體為L4440-Trypsin-9。