[發明專利]基于DSN酶檢測Hg2+

在審

• 申請號: 202010612679.5
• 申請日: 2020-06-30
• 公開（公告）號: CN113862259A
• 公開（公告）日: 2021-12-31
• 發明（設計）人: 曾冬冬;朱長鋒;沈錫中;徐曉慧;李暉
• 申請（專利權）人: 上海健康醫學院
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/00;G01N21/64
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 陸惠中;田歡

本發明屬于生物領域，具體涉及一種基于DSN酶檢測Hg²⁺的DNA生物傳感器。本發明首先公開了一種用于Hg²⁺濃度檢測的核苷酸序列組，其包括：核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的T?探針、核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的序列M和核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的序列M4。其次還公開了一種包括上述核苷酸序列組的DNA生物傳感器。本發明成功構建了一種基于DSN酶的DNA生物傳感器并成功用于Hg²⁺的檢測。該傳感器具有結構簡單、操作簡單、靈敏度高、穩定性高以及選擇性高的特點。

技術領域

本發明屬于生物領域，具體涉及一種基于DSN酶檢測Hg²⁺的DNA生物傳感器。

背景技術

雙鏈特異性核酸酶(duplex-specificnuclease，DSN)是一種新型的核酸酶，已從蝦、蟹等生物的消化腺或肝胰腺中成功分離出^[1]。DSN酶對于雙鏈DNA(dsDNA)以及DNA和RNA雜交體中的DNA具有特異性的剪切效果，并且對于單鏈DNA(sDNA)以及RNA形成的雙鏈結構幾乎沒有生物活性。在對DNA-RNA雜交體中的DNA進行水解時，還可以保持RNA鏈的完整性。由于DSN酶的這一特性，DSN酶被廣泛的應用于miRNA的檢測中^[2-6]。其次，DSN酶剪切dsDNA和DNA-RNA雜交體中的DNA鏈時，對雙鏈的堿基對數有要求。只有當DNA雙鏈的堿基對數大于10bp時，DSN酶才能水解DNA，而在DNA-RNA雜交體中，只有堿基對數大于15bp時，DSN酶才能對雜交體中的DNA鏈進行剪切。此外，DSN酶在對于相同長度的dsDNA或DNA-RNA雜交體進行水解作用時，對堿基對完全匹配的雙鏈水解速度要高于堿基對非完全匹配的雙鏈，基于此，DSN酶可以很好地區分單堿基錯配。由于DSN酶具有的這些特性，DSN酶被廣泛應用于生物醫學和生物科學研究中，比如cDNA文庫的構建^[7,8]、基因組DNA的均一化、SNP檢測^[4]以及端粒末端定量檢測^[9]等方面。

眾所周知汞是一種有毒的重金屬，并且汞產品在人們的生活中隨處可見。然而由于工廠污水或廢棄的汞產品的處理不當等原因，自然界中就會存在一定量的汞離子，這些汞離子可以通過生物富集作用進入生物體內，進而轉化成毒性更高的有機汞，并通過食物鏈進入人體。因此尋找一種簡單、方便、廉價的測量環境中汞離子濃度的方法是很有必要的。

研究表明，汞離子可以與錯配的堿基對T-T形成T-Hg²⁺-T結構，使得帶有T-T錯配堿基對的DNA鏈形成完全匹配的DNA雙鏈^[10-12]。而在以往的研究中，DSN酶大多被用于miRNA的檢測中，很少用于對汞離子的檢測中。

發明內容

在本發明中，將DSN酶與DNA生物傳感器相結合，設計了兩條帶有T-T堿基錯配的互補DNA單鏈，并在其中一條DNA鏈上修飾上FAM熒光基團以及BHQ熒光淬滅基團形成DNA熒光探針，通過加入不同濃度的汞離子使DNA形成完全匹配的DNA雙鏈，進而被DSN酶水解，其檢測結果表現為熒光強度的變化。

具體的，本發明的技術方案如下：

本發明第一個方面公開了一種用于Hg²⁺濃度檢測的核苷酸序列組，包括：核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的T-探針、核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的序列M和核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的序列M4；優選的，所述T-探針的5’端修飾有熒光基團，3’端修飾有熒光淬滅基團。

本發明第二個方面公開了一種DNA生物傳感器，包括上述的核苷酸序列組；優選的，所述DNA生物傳感器還包括DSN酶。

本發明第三個方面公開了上述的DNA生物傳感器在檢測Hg²⁺濃度中的應用。

本發明第四個方面公開了一種制備上述的DNA生物傳感器的方法，包括：