[發明專利]一種快速鑒定轉基因擬南芥陽性植株的方法

在審

• 申請號: 202010609570.6
• 申請日: 2020-06-29
• 公開（公告）號: CN111896506A
• 公開（公告）日: 2020-11-06
• 發明（設計）人: 閆志強;王曉雪;鄧茹月;朱訴訟;尹燕斌;夏忠敏;宮彥龍;王忠妮
• 申請（專利權）人: 貴州省水稻研究所
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;C12N15/82;C12N15/65;A01G7/00
• 代理公司: 北京安信方達知識產權代理有限公司 11262
• 代理人: 陳丹;張奎燕

本發明公開了一種快速鑒定轉基因擬南芥陽性植株的方法，所述方法包括將熒光蛋白基因和目標基因片段插入到雙元載體中，隨后轉化農桿菌；用經轉化的農桿菌轉化擬南芥，收獲擬南芥種子；將收獲的種子播種在篩選培養基上，以篩選轉基因擬南芥陽性植株；出苗后，觀察擬南芥陽性植株的植物部位，如果檢測到熒光信號，則可以確定該植株為轉基因陽性植株，如果未檢測到熒光信號，則該植株是假陽性植株。該方法簡化了篩選步驟、縮短了篩選周期、提高了篩選效率。

技術領域

本發明涉及植物基因工程技術領域。具體地，本發明涉及一種快速鑒定轉基因擬南芥陽性植株的方法。

背景技術

擬南芥是長日模式植物，具有植株形態個體小、生長周期短、結實多的特點，從播種到收獲種子一般只需6周左右，每株植物可產生數千粒種子。因此，擬南芥被廣泛用于植物遺傳學研究。在反向遺傳學領域，擬南芥更是起到了舉足輕重的作用。例如，可以根據擬南芥的已知基因尋找該基因在其它植物物種中的同源基因，通過構建超表達載體創建超表達突變體、下調表達突變體，或利用基因編輯創建基因敲除突變體，從而進行基因功能驗證。目前很多生物學過程的調控通路在擬南芥中研究得相對透徹，因此，其它作物也會借鑒擬南芥已知的調控通路。用目標基因轉化擬南芥，有助于對目標基因的功能及分子機理進行研究。

目前擬南芥轉基因植株陽性植株的篩選主要是借助轉基因載體中的潮霉素抗性基因進行篩選，但是擬南芥的種子量大，容易篩選到一定量的假陽性植株，繼而不利地影響純合植株的篩選以及接下來的基因功能研究。為了避免這種情況，通常會在移栽轉基因擬南芥植株后，對其中的標記基因(例如β-葡萄糖苷酶基因(GUS)、潮霉素基因、目標基因等)進行分子水平檢測，以明確每株轉基因擬南芥植株的真偽。這個過程費時費力。

發明內容

為了克服現有技術的不足，本發明提供了熒光蛋白基因作為篩選標記基因在篩選轉基因擬南芥陽性植株中的應用。

本發明通過對雙元載體進行改造，將熒光蛋白(例如綠色熒光蛋白，GFP)基因插入到雙元載體中，借助轉基因載體中的GFP的表達，在潮霉素抗性培養基篩選后、移栽植株前，通過顯微鏡直接觀察擬南芥的部位(例如根部、花瓣或子房)進行GFP檢測，從而篩選轉基因擬南芥陽性苗。本發明提供的方法一方面可以排除潮霉素篩選中的假陽性苗，另一方面可以省去大規模提取DNA及分子水平檢測所需的時間和精力。

在第一方面，本發明提供了一種篩選轉基因擬南芥陽性植株的方法，所述方法包括：

1.將目標基因片段插入到經改造的雙元載體中；

2.用步驟1中制備的雙元載體轉化農桿菌；

3.用經轉化的農桿菌轉化擬南芥，并繼續培養直到收獲種子；

4.將收獲的種子播種在篩選培養基，以篩選轉基因擬南芥陽性苗；

5.出苗后，在熒光顯微鏡下觀察擬南芥陽性苗的部位，如果檢測到熒光信號，則可以確定該植株為轉基因陽性苗，如果未檢測到熒光信號，則該植株是假陽性苗；

其中，所述經改造的雙元載體能夠表達熒光蛋白；

所述熒光蛋白是例如但不限于綠色熒光蛋白(GFP)、紅色熒光蛋白(RFP)、黃色熒光蛋白(YFP)、藍色熒光蛋白(BFP)以及它們的增強型熒光蛋白，也可以是本領域普通技術人員熟知的其他熒光蛋白；在一些實施方案中，熒光蛋白是綠色熒光蛋白；

優選地，雙元載體的實例包括但不限于pCAMBIA1300、pCAMBIA1301、pTCK303和pRGEB32載體；在一些實施方案中，雙元載體是pCAMBIA1300載體。

在一些實施方案中，目標基因的啟動子和編碼序列(CDS)通過在公開可得的數據庫例如NCBI獲得。接下來通過PCR或其他核酸擴增方法擴增目標基因。在一個具體實例中，PCR擴增反應體系如下(總計50μL)：