[發(fā)明專(zhuān)利]傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白及其編碼基因與應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010597896.1
• 申請(qǐng)日: 2020-06-28
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111662364A
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-09-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孫娜;姜俊兵;范闊海;李宏全;孫耀貴;尹偉;孫盼盼
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C07K14/08
• 分類(lèi)號(hào): C07K14/08;A61K39/12;A61P31/14;C12N15/81;C12N15/40;C12R1/84
• 代理公司: 太原科衛(wèi)專(zhuān)利事務(wù)所(普通合伙) 14100
• 代理人: 張彩琴;李曉娟

本發(fā)明屬于生物技術(shù)制藥工業(yè)中基因工程領(lǐng)域，具體是一種傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白的編碼基因，其堿基序列如SEQ ID NO:1所示。本發(fā)明所述的傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白很好地利用了VP2和Pichia pastoris的優(yōu)點(diǎn)，其編碼基因可以在Pichia pastoris中高效表達(dá)，降低了生產(chǎn)成本，將此重組蛋白在制備傳染性法氏囊病疫苗中的應(yīng)用，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和巨大的社會(huì)效益。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)制藥工業(yè)中基因工程領(lǐng)域，具體是一種傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。

背景技術(shù)

傳染性法氏囊病（Infectious Bursal Disease，IBD）在世界各地都有發(fā)生，給養(yǎng)雞業(yè)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失。傳染性法氏囊病病毒（Infectious Bursal Disease Virus，IBDV）是引發(fā)IBD的病原。目前，該病毒的中等毒力活疫苗、弱毒疫苗和滅活疫苗在IBDV的預(yù)防中被廣泛地應(yīng)用。然而，中等毒力活疫苗雖然能夠抵抗IBDV超強(qiáng)毒株的攻擊，但會(huì)對(duì)雞的法氏囊產(chǎn)生一定的損傷。另外，使用活疫苗還存在病毒重組和毒力反強(qiáng)的風(fēng)險(xiǎn)。常規(guī)減毒活病毒疫苗的相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)使得開(kāi)發(fā)安全有效的新型疫苗成為必要。其中，亞單位疫苗已成為當(dāng)前新型疫苗研究的熱點(diǎn)。在IBDV的5種蛋白中，只有VP2和VP3是結(jié)構(gòu)蛋白，共同構(gòu)成病毒的核衣殼。VP2蛋白位于核衣殼表面是病毒最主要保護(hù)性抗原，也是IBDV亞單位疫苗開(kāi)發(fā)的靶蛋白。

本發(fā)明通過(guò)畢赤酵母真核表達(dá)系統(tǒng)對(duì)IBDV超強(qiáng)毒株UK661的VP2蛋白進(jìn)行表達(dá)，用表達(dá)的VP2蛋白進(jìn)行免疫保護(hù)試驗(yàn)，以期能為傳染性法氏囊病亞單位疫苗的開(kāi)發(fā)提供一定的理論依據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明利用傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白和Pichia pastoris的優(yōu)點(diǎn)，提供了一種傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。

本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

所述傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白在制備傳染性法氏囊病疫苗中的應(yīng)用。

本發(fā)明進(jìn)一步提供了所述傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白的制備方法，包括以下步驟：

表達(dá)載體的構(gòu)建：人工合成的VP2的基因序列上設(shè)計(jì)有限制性?xún)?nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，將VP2的基因序列和表達(dá)質(zhì)粒pwPICZalpha用同樣的限制性?xún)?nèi)切酶酶切后連接在一起，通過(guò)雙酶切檢測(cè)和篩選含有VP2的基因序列的克隆；

酵母表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建：使用限制性?xún)?nèi)切酶線(xiàn)性化重組表達(dá)質(zhì)粒，通過(guò)電轉(zhuǎn)化的方法，將VP2的基因序列整合到酵母的基因組中；將轉(zhuǎn)化后的菌體懸液涂布于含有Zeocin的YPD平板上，30℃培養(yǎng)；挑取單單菌落，進(jìn)行小劑量的誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE檢測(cè)表達(dá)上清確認(rèn)陽(yáng)性克??；

重組蛋白的純化和活性檢測(cè)：挑選陽(yáng)性克隆菌落進(jìn)行大劑量的誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)上清采用Protein Pure Ni-NTA 樹(shù)脂純化，通過(guò)SDS-PAGE和Western blot檢測(cè)純化的重組蛋白。

本發(fā)明進(jìn)一步提供了傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白的編碼基因，其堿基序列如SEQID NO:1所示。

所述傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白的編碼基因是由編碼傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白的cDNA序列、6個(gè)組氨酸cDNA序列和限制性?xún)?nèi)切酶Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ位點(diǎn)的cDNA序列以及符合酵母表達(dá)偏好性的基因序列組成的。

本發(fā)明所述的傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白很好地利用了VP2和Pichia pastoris的優(yōu)點(diǎn)，其編碼基因可以在Pichia pastoris中高效表達(dá)，降低了生產(chǎn)成本，將此重組蛋白在制備傳染性法氏囊病疫苗中的應(yīng)用，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和巨大的社會(huì)效益。