[發明專利]磷酸化蛋白質、基于磷酸化蛋白質的胞內遞送體系及制備方法與應用

有效

• 申請號: 202010596468.7
• 申請日: 2020-06-27
• 公開（公告）號: CN111848975B
• 公開（公告）日: 2022-07-19
• 發明（設計）人: 殷黎晨;劉勇;吳宇辰
• 申請（專利權）人: 蘇州大學
• 主分類號: A61K49/14
• 分類號: A61K49/14
• 代理公司: 蘇州創元專利商標事務所有限公司 32103
• 代理人: 孫周強;陶海鋒

本發明公開了磷酸化蛋白質、基于磷酸化蛋白質的胞內遞送體系及制備方法與應用；提供了一種蛋白質磷酸化修飾方法，所述磷酸化蛋白質具有蛋白質結構、通過氨基接于所述蛋白質表面的苯硼酸基團和通過硼酸與鄰二醇反應接于所述蛋白質表面的三磷酸腺苷；將陽離子多肽溶液和磷酸化蛋白質在堿液中混合，震蕩后靜置，得到基于磷酸化蛋白質的胞內遞送體系。在腫瘤細胞內低pH值和高濃度的活性氧環境下，苯硼酸和三磷酸腺苷從蛋白質表面脫落，蛋白質與陽離子聚多肽的作用力減弱，從復合物中釋放出來，同時恢復活性，殺死腫瘤細胞。

技術領域

本申請涉及磷酸化蛋白質，更具體涉及用于蛋白質胞內遞送體系的磷酸化蛋白質。

背景技術

目前市場上所有蛋白藥物都是基于細胞外靶點開發的，如細胞膜蛋白（程序性細胞死亡受體1，PD-1；人表皮生長因子受體2，HER2；胰島素受體等）和分泌蛋白（腫瘤壞死因子α，TNFα；白介素12，IL12；血管內皮生長因子，VEGF等）。這主要是因為蛋白質的大分子性質和親水性使它不具備滲透細胞膜的能力。然而，約有70%以上的基因組編碼蛋白位于細胞內。由于無法滲透細胞膜，這些蛋白很難被“藥物化”。因此，近年來人們越來越重視開發簡便、高效的胞內蛋白遞送體系。

將具有穿膜功能的組分與蛋白共價結合是一種常見的蛋白胞內遞送方式。常見的具有穿膜功能的組分包括蛋白質轉導結構域、細胞滲透肽、陽離子聚合物以及一些兩親性小分子。功能化修飾后的蛋白具有更優異的穿膜能力，但這樣的化學改性策略很難將具有穿膜功能的化學物質修飾到蛋白的特定位點上，改性后蛋白的生物活性可能會不可逆轉地降低或改變。因此，人們用各種動態共價鍵連接蛋白與功能基團。通過動態共價鍵修飾的蛋白能夠在內源或外源性的刺激下釋放載荷蛋白，發揮功效。另一種常用的蛋白胞內遞送策略是使用遞送載體，如脂質體、細胞衍生小泡、無機納米顆粒、納米凝膠和聚合物。這些載體一般通過非共價相互作用與蛋白結合。蛋白質是一類電荷性質不確定、體積較大的生物分子，蛋白質表面可與載體結合的位點數量有限。此外，不同蛋白之間等電點、親疏水性等性質差異很大，因此很難設計具有通用性的蛋白遞送體系。

發明內容

本發明通過對蛋白質進行特定的磷酸化修飾，并通過陽離子聚多肽輔助，解決上述問題，可有效穿透細胞膜，且獲得的納米藥物粒徑小。

本發明采用如下技術方案：

磷酸化蛋白質，由蛋白質、苯硼酸分子、磷酸腺苷制備得到。

基于磷酸化蛋白質的胞內遞送體系，包括上述磷酸化蛋白質與陽離子多肽。

本發明中，蛋白質上的胺基、苯硼酸分子、磷酸腺苷的摩爾比為1∶（1.3～1.8）∶（1.2～1.8），得到的磷酸化蛋白質與陽離子多肽復合后，得到的納米藥物粒徑小且穩定性好。

本發明中，磷酸化蛋白質與陽離子多肽的質量比為1∶（0.5～10）。

本發明中，苯硼酸分子為4-羥甲基苯硼酸頻那醇羰基咪唑；磷酸腺苷為三磷酸腺苷。

本發明中，陽離子多肽具有如下化學結構式：

本發明磷酸化蛋白質的制備方法為，將苯硼酸分子溶液加入蛋白質磷酸鹽緩沖液中，反應得到R-PBA溶液；然后加入磷酸腺苷溶液，反應得到磷酸化蛋白質。

上述技術方案中，反應為室溫反應。

本發明基于磷酸化蛋白質的胞內遞送體系的制備方法為，將陽離子多肽溶液和磷酸化蛋白質在堿液中混合，震蕩后靜置，得到基于磷酸化蛋白質的胞內遞送體系。堿液為碳酸氫鈉水溶液。

本發明進一步公開了所述磷酸化蛋白質或者基于磷酸化蛋白質的胞內遞送體系在制備納米藥物，尤其是抗腫瘤蛋白藥物中的應用。