[發(fā)明專利]一種rrbp1基因敲除熱帶爪蛙模型的制備方法與應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010594255.0
• 申請日: 2020-06-28
• 公開（公告）號: CN111718933B
• 公開（公告）日: 2022-01-28
• 發(fā)明（設計）人: 齊緒峰;張舟;蔡冬青;劉光輝;趙暉;鄭莉;樸圭祥;馮珊珊
• 申請（專利權）人: 暨南大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/90;C12N15/89;C12N15/12;A01K67/027
• 代理公司: 廣州市華學知識產(chǎn)權代理有限公司 44245
• 代理人: 蘇運貞

1.一種rrbp1基因敲除熱帶爪蛙模型的制備方法，其特征在于包括如下步驟：

（1）設計sgRNA：利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)選擇rrbp1基因敲除靶點，設計sgRNA序列及其互補序列；

（2）體外合成sgRNA：將步驟（1）設計的sgRNA序列及其互補序列退火，形成雙鏈DNA片段，構建sgRNA表達載體，體外轉錄，得到sgRNA；

（3）顯微注射：將步驟（2）得到的sgRNA與Cas9蛋白混合，顯微注射到受精卵中；

（4）培育：將步驟（3）顯微注射后的受精卵培養(yǎng)至成蛙，獲得 F0代嵌合體熱帶爪蛙，將其與野生型雜交，得到F1代雜合子，自交，得到F2代純合子，即rrbp1基因敲除熱帶爪蛙模型；

步驟（1）中所述的rrbp1基因敲除靶點位于rrbp1基因第一外顯子，該外顯子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

步驟（1）中所述的sgRNA序列及其互補序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

2.根據(jù)權利要求1所述的rrbp1基因敲除熱帶爪蛙模型的制備方法，其特征在于，

步驟（2）中所述的sgRNA序列及其互補序列退火前加入BbsI酶切位點粘性末端，正義鏈5’端添加TAGG；反義鏈5’端添加AAAC；

步驟（2）中所述的構建sgRNA表達載體采用的載體為pUC57-Simple-gRNA；所述的pUC57-Simple-gRNA采用BbsI酶切。

3.根據(jù)權利要求1所述的rrbp1基因敲除熱帶爪蛙模型的制備方法，其特征在于，

步驟（3）中所述的sgRNA與Cas9蛋白的注射用量分別為100 pg/卵和300 pg/卵；

步驟（3）中所述的受精卵為1細胞期的受精卵；

步驟（3）中所述的受精卵注射前采用pH 7.8-8.0的一水合半胱氨酸鹽酸鹽作為脫膜液進行脫膠膜處理。

4.根據(jù)權利要求1所述的rrbp1基因敲除熱帶爪蛙模型的制備方法，其特征在于，

步驟（2）中所述的sgRNA序列及其互補序列退火的體系：濃度為100 μM的sgRNA序列及其互補序列各1 μL、T4 PNK0.5 μL、10×T4 ligation buffer1 μL、RNase-free water補充至10 μL；退火的程序：37℃、30 min；95℃、5 min；-5℃/min逐步降溫至25℃；

步驟（2）中所述的構建sgRNA表達載體的連接體系：雙鏈DNA片段1 μL、線性化的pUC57-Simple-gRNA1 μL、T4 DNA ligase1 μL、10×T4 ligation buffer1 μL、RNase-free water補充至10 μL；反應條件：22℃、3 h。

5.根據(jù)權利要求2所述的rrbp1基因敲除熱帶爪蛙模型的制備方法，其特征在于，

所述的酶切的反應體系：pUC57-Simple-gRNA1 μg、酶切buffer 2 μL、10 U/μLBbsI酶1μL、RNase-free water補充至20 μL；反應條件：37℃、2 h。

6.權利要求1-5任一項所述的rrbp1基因敲除熱帶爪蛙模型的制備方法在熱帶爪蛙模式動物種質(zhì)資源創(chuàng)新中的應用。