[發(fā)明專利]用于新型冠狀病毒快速篩查鑒定的引物及試劑盒和用途

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010594235.3
• 申請(qǐng)日: 2020-06-28
• 公開（公告）號(hào): CN111893213A
• 公開（公告）日: 2020-11-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 袁向芬;鄧企飛;呂繼洲;吳紹強(qiáng);林祥梅
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 北京秉文同創(chuàng)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11859
• 代理人: 張文武;孫富利

本發(fā)明涉及用于新型冠狀病毒快速篩查鑒定的引物及試劑盒和用途。公開一種檢測(cè)SARS?CoV2病毒的引物組，所述引物組由LAMP引物組成，以SARS?CoV2病毒S基因、ORF1ab基因檢測(cè)靶點(diǎn)，利用該引物組進(jìn)一步開發(fā)出一種設(shè)備簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)便，靈敏度和特異性高的SARS?CoV?2核酸檢測(cè)方法。本發(fā)明的檢測(cè)SARS?CoV2病毒LAMP體系在臨床檢測(cè)上表現(xiàn)優(yōu)異，臨床樣本檢測(cè)符合率100％，獲得上海市臨床檢驗(yàn)中心組織頒發(fā)的證書，具有良好的市場(chǎng)應(yīng)用前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于應(yīng)用生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及篩查鑒定新型冠狀病毒的特異性篩查鑒定引物、鑒定方法及鑒定試劑盒。

背景技術(shù)

病毒性肺炎多見于冬春季，可散發(fā)或暴發(fā)流行，臨床主要表現(xiàn)為發(fā)熱、渾身酸痛、少部分有呼吸困難，肺部浸潤(rùn)影。據(jù)統(tǒng)計(jì)，90％以上的急性呼吸道感染是由病毒引起。主要包括流感病毒、鼻病毒、腸道病毒、呼吸道合胞病毒、冠狀病毒等，可侵犯上呼吸道的不同部位，引起炎癥。冠狀病毒為不分節(jié)段的單股正鏈RNA病毒，屬于巢病毒目(Nidovirales)冠狀病毒科(Coronaviridae)正冠狀病毒亞科(Orthocoronavirinae)。冠狀病毒有包膜，顆粒呈圓形或橢圓形，經(jīng)常為多形性，直徑50～200nm。S蛋白位于病毒表面形成棒狀結(jié)構(gòu)，作為病毒的主要抗原蛋白之一，是用于分型的主要基因。N蛋白包裹病毒基因組，可用作診斷抗原。

新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)新型冠狀病毒屬于β屬冠狀病毒，其遺傳物質(zhì)是單條正義RNA 鏈。張永振教授團(tuán)隊(duì)利用測(cè)序技術(shù)確定該RNA病毒的基因組，并第一時(shí)間公布相關(guān)病毒序列 (GenBank MN908947)，近3萬個(gè)堿基的長(zhǎng)度。基于已知基因組序列，最常用的病毒快速檢測(cè)技術(shù)主要有兩大類：核酸檢測(cè)和抗原抗體免疫檢測(cè)。核酸(DNA或RNA)是病毒的遺傳物質(zhì)，篩選其獨(dú)一無二的特征核酸序列進(jìn)行檢測(cè)即可確定病原體.而病毒作為抗原可激發(fā)人體免疫反應(yīng)產(chǎn)生抗體，抗原抗體特異性相互結(jié)合的特性可作為檢測(cè)的理論基礎(chǔ)。

SARS-CoV-2核酸檢測(cè)可為診斷提供直接證據(jù)，在目前最新版本診療方案中，SARSCoV-2核酸的檢出仍是唯一確診依據(jù)。實(shí)時(shí)熒光逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)方法是目前針對(duì)于 SARS-CoV-2核酸檢測(cè)的首選方法，如中國(guó)疾病預(yù)防控制中心就發(fā)布了針對(duì)于SARS-CoV-2的開放讀碼框1ab(ORF1ab)和核殼蛋白(N)特異性靶位基因核酸qRT-PCR檢測(cè)所對(duì)應(yīng)的引物和探針序列。但其有其天然的缺陷，需要昂貴的檢測(cè)儀器、試劑和專業(yè)技術(shù)人員，檢測(cè)成本高，更加無法滿足突發(fā)事件中基層及現(xiàn)場(chǎng)的快速檢測(cè)需求。

目前，采用定量PCR的方法對(duì)新型冠狀病毒進(jìn)行臨床檢測(cè)的過程中出現(xiàn)了不少問題，例如，出現(xiàn)了臨床癥狀及影像學(xué)高度疑似的SARS-CoV-2患者，但核酸檢測(cè)呈陰性；部分患者需反復(fù)數(shù)次檢測(cè)才能確定。究其原因，核酸檢測(cè)結(jié)果的陰陽性，其容易受到樣本中來自病人體內(nèi)不同化學(xué)物質(zhì)的抑制，從而影響檢測(cè)的靈敏度。尤其是現(xiàn)在臨床上已出現(xiàn)沒有癥狀的人群具有傳染性的現(xiàn)象，這對(duì)于新型冠狀病毒傳染的管控帶來了很大的不確定性。

2000年日本研究人員Notomi等人發(fā)明了一種新型的核酸體外恒溫?cái)U(kuò)增特異片段的分子檢測(cè)技術(shù)，即環(huán)介導(dǎo)的恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)。與傳統(tǒng)核酸擴(kuò)增技術(shù)比較，LAMP的主要特點(diǎn)是：靈敏度和特異性高，與PCR相比高出幾個(gè)數(shù)量級(jí)。利用外引物和內(nèi)引物與目的片段6個(gè)特異性部位準(zhǔn)確結(jié)合發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)，只有當(dāng)2對(duì)引物與目的片段6個(gè)區(qū)域都匹配時(shí)才進(jìn)行擴(kuò)增。LAMP擴(kuò)增結(jié)果只有是和否，相比于PCR具更高特異性。檢測(cè)速度快、擴(kuò)增效率高，LAMP是恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，無需預(yù)先熱變性雙鏈DNA，避過PCR退火、復(fù)性過程，避免溫度循環(huán)而造成的時(shí)間損失，能夠滿足臨床樣本的快速檢測(cè)需要。加入環(huán)引物后，可在30-45分鐘內(nèi)完成反應(yīng)；設(shè)備簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)便：由 LAMP反應(yīng)只需要如水浴鍋、金屬浴等恒溫器即可完成此實(shí)驗(yàn)，不需要購置昂貴的PCR儀，易于推廣應(yīng)用。產(chǎn)物易檢測(cè)：根據(jù)LAMP反應(yīng)特性，判斷產(chǎn)物結(jié)果的方法有瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)法、濁度檢測(cè)法和熒光比色檢測(cè)法等，其中，濁度檢測(cè)法基于LAMP反應(yīng)過程中產(chǎn)生大量的焦磷酸鎂沉淀，可根據(jù)是否形成白色沉淀來定性判斷結(jié)果，簡(jiǎn)單高效。