[發明專利]利用原核轉錄系統制備重組真核mRNA的方法及其應用

在審

• 申請號: 202010593876.7
• 申請日: 2020-06-24
• 公開（公告）號: CN111893128A
• 公開（公告）日: 2020-11-06
• 發明（設計）人: 陳博;李冉;王儒愷
• 申請（專利權）人: 蘇州市澤悅生物技術有限公司
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/12
• 代理公司: 蘇州華博知識產權代理有限公司 32232
• 代理人: 何蔚

1.利用原核轉錄系統制備重組真核mRNA的方法。

2.如權利要求1所述的利用原核轉錄系統制備重組真核mRNA的方法，其特征在于，所述方法的步驟包括：1)表達用于重組真核mRNA轉錄與加帽過程所需的酶系統，獲得原核體外轉錄-加帽酶系統→2)制備線性化轉錄模板DNA→3)重組真核mRNA的轉錄、加帽與純化。

3.根據權利要求2所述的利用原核轉錄系統制備重組真核mRNA的方法，其特征在于，所制備的重組真核mRNA分子具備真核生物在蛋白翻譯過程中所需的所有mRNA特征，能夠進一步被真核翻譯系統所識別并利用。

4.根據權利要求2所述的利用原核轉錄系統制備重組真核mRNA的方法，其特征在于，所述步驟1)是，在原核細胞體內同時表達轉錄重組mRNA所需的RNA聚合酶和mRNA 5′端加帽所需的酶系統，表達后的原核細胞經裂解，制得含有重組RNA聚合酶和加帽酶的細胞裂解物，即原核體外轉錄-加帽酶系統。

5.根據權利要求2所述的利用原核轉錄系統制備重組真核mRNA的方法，其特征在于，所述步驟2)包括：重組mRNA轉錄模板質粒的設計→將重組目的mRNA對應的DNA序列克隆至轉錄模板質粒的多克隆位點處，得到重組mRNA轉錄模板質粒→將重組mRNA轉錄模板質粒線性化，得到線性化轉錄模板DNA。

6.根據權利要求2所述的利用原核轉錄系統制備重組真核mRNA的方法，其特征在于，所述步驟3)是，將步驟1)所制得的原核體外轉錄-加帽酶系統和步驟2)所制得的線性化DNA模板混合后反應，在體外條件下反應合成制備出重組目的mRNA分子，再將重組目的mRNA純化。

7.根據權利要求4所述的利用原核轉錄系統制備重組真核mRNA的方法，其特征在于，所述重組mRNA所需的RNA聚合酶為單亞基的RNA聚合酶。

8.根據權利要求7所述的利用原核轉錄系統制備重組真核mRNA的方法，其特征在于，所述重組mRNA所需的單亞基RNA聚合酶至少包括T7 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶、SP6 RNA聚合酶、K11 RNA聚合酶或N4 RNA聚合酶。

9.根據權利要求8所述的利用原核轉錄系統制備重組真核mRNA的方法，其特征在于，所述重組mRNA所需的RNA聚合酶采用T7 RNA聚合酶。

10.根據權利要求4所述的利用原核轉錄系統制備重組真核mRNA的方法，其特征在于，所述mRNA 5′端加帽所需的酶系統是任意能夠將mRNA的5′端修飾成“帽子”結構或類似“帽子”結構的酶或酶系統。

11.根據權利要求10所述的利用原核轉錄系統制備重組真核mRNA的方法，其特征在于，所述mRNA 5′端加帽所需的酶系統采用牛痘病毒的mRNA加帽酶系統。

12.根據權利要求5所述的利用原核轉錄系統制備重組真核mRNA的方法，其特征在于，所述重組mRNA轉錄模板DNA采用線性化的質粒；所述重組mRNA轉錄模板質粒含有一個融合了原核轉錄元件和真核翻譯元件的雜合表達框，其至少包括以下特征：起始重組mRNA轉錄的原核啟動子、提高真核生物翻譯效率以及mRNA穩定性的5′UTR序列、可以直接通過酶切-連接的形式將目的mRNA對應的DNA序列插入基因表達框中的多克隆位點、提高真核生物翻譯效率以及mRNA穩定性的3′UTR序列、包括30-200個連續的腺苷酸的多聚腺苷酸序列以及緊隨其后的質粒線性化位點。

13.根據權利要求12所述的利用原核轉錄系統制備重組真核mRNA的方法，其特征在于，所述多克隆位點的序列為：5′-ATGGGTACCGTCGACTCTAGACTCGAGGGATCCGAATTCAGCTAGCCTTAA-3′。