[發(fā)明專利]一種高純度重組白介素-2的制備工藝

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010592543.2
• 申請日: 2020-06-24
• 公開（公告）號: CN111676261A
• 公開（公告）日: 2020-09-18
• 發(fā)明（設計）人: 朱文瑾;李浛民;陳平
• 申請（專利權）人: 寧波博睿瀚達生物科技有限公司
• 主分類號: C12P21/02
• 分類號: C12P21/02;C07K1/14;C07K1/20;C07K1/18
• 代理公司: 寧波市鄞州盛飛專利代理事務所(特殊普通合伙) 33243
• 代理人: 邢麗艷;洪珊珊

1.一種高純度重組白介素-2的制備工藝，其特征在于，所述高純度重組白介素-2的制備工藝包括如下步驟：

S1、制備白介素-2復性液：以大腸桿菌基因重組形成白介素-2發(fā)酵液，從白介素-2發(fā)酵液提取包涵體，將包涵體裂解，并進行復性處理，得到白介素-2復性液；

S2、粗純處理：將白介素-2復性液加入到疏水高效液相色譜柱進行吸附和洗脫，收集洗脫液即為粗純產(chǎn)物；

S3、精純處理：將粗純產(chǎn)物加入到反相高效液相色譜柱中進行吸附和洗脫，收集洗脫液即為精純產(chǎn)物；

S4、終純處理：將精純產(chǎn)物加入到弱陰離子高效液色譜柱中進行吸附和洗脫，收集洗脫液即為高純度重組白介素-2。

2.根據(jù)權利要求1所述的高純度重組白介素-2的制備工藝，其特征在于，步驟S1所述提取包涵體的方法為對重組白介素-2發(fā)酵液進行超聲破菌處理，然后離心、用40～60mmol/L、PH8.5～9.0的PBS緩沖液進行洗滌；

所述包涵體裂解在裂解劑中進行，所述裂解劑包括以下組分：0.8～1.2wt％十二烷基硫酸鈉(SDS)、8～13mmol/L二硫蘇糖醇(DTT)、40～60mmol/L PB緩沖液，所述PB緩沖液的PH為7.0～8.0；

所述復性處理的方法為：先采用0.8～1.2wt％十二烷基硫酸鈉(SDS)將包涵體裂解液稀釋至蛋白濃度不超過4mg/ml，然后加入復性劑攪拌稀釋至包涵體裂解液中的蛋白濃度為0.1～0.2mg/ml，且十二烷基硫酸鈉(SDS)濃度至0.05～0.06wt％。

3.根據(jù)權利要求1所述的高純度重組白介素-2的制備工藝，其特征在于，步驟S2所述疏水高效液相色譜柱的填料以硅膠為基質(zhì)，表面鍵合疏水性基團，所述疏水性基團為苯基基團。

4.根據(jù)權利要求1所述的高純度重組白介素-2的制備工藝，其特征在于，步驟S2所述洗脫包括采用洗脫液Ⅰ進行第一次洗脫，然后采用洗脫液Ⅱ進行第二次洗脫，收集第二次洗脫的流出液即為粗純產(chǎn)物，所述洗脫液Ⅰ包括以下組分：8～12v％乙醇、1.8～2.2mo1/L脲素、0.07～0.13v％三氟乙酸(TFA)，所述洗脫液Ⅱ包括以下組分：30～50v％乙醇，0.07～0.13v％三氟乙酸(TFA)。

5.根據(jù)權利要求1所述的高純度重組白介素-2的制備工藝，其特征在于，步驟S3所述反相高效液相色譜柱的填料以硅膠為基質(zhì)，表面鍵合C4基團。

6.根據(jù)權利要求1所述的高純度重組白介素-2的制備工藝，其特征在于，步驟S3所述洗脫包括采用A液進行初步洗脫，隨后增加B液并逐漸提高B液用量/A液用量的比例進行梯度洗脫，所述A液為8～12v％乙醇和0.08～0.12v％三氟乙酸的混合，所述B液為40～60v％乙醇和0.08～0.12v％三氟乙酸的混合。

7.根據(jù)權利要求1所述的高純度重組白介素-2的制備工藝，其特征在于，步驟S4所述將精純產(chǎn)物加入到弱陰離子高效液色譜柱中進行吸附和洗脫前還有在精純產(chǎn)物中添加助溶劑十二烷基硫酸鈉(SDS)、并調(diào)節(jié)PH至7.0～7.5，然后添加氯化鈉的步驟。

8.根據(jù)權利要求1所述的高純度重組白介素-2的制備工藝，其特征在于，步驟S4所述陰離子高效液相色譜柱采用DEAE陰離子交換填料。

9.根據(jù)權利要求8所述的高純度重組白介素-2的制備工藝，其特征在于，步驟S4所述洗脫包括采用平衡液對弱陰離子高效液相色譜柱進行第一次洗脫，所述平衡液中含有濃度為0.8～1.2mol/L的氯化鈉，然后采用Tris-HCL緩沖液進行第二次洗脫，收集第二次洗脫的流出液，即為高純度重組白介素-2。