[發明專利]細粒棘球絳蟲原頭節源和囊液源外泌體非編碼RNA表達譜分析方法及非編碼RNA序列

在審

• 申請號: 202010591112.4
• 申請日: 2020-06-24
• 公開（公告）號: CN113832234A
• 公開（公告）日: 2021-12-24
• 發明（設計）人: 沈玉娟;張小凡;曹建平;曹勝魁;張璟
• 申請（專利權）人: 中國疾病預防控制中心寄生蟲病預防控制所（國家熱帶病研究中心）
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/6851;C12N15/113
• 代理公司: 上海市匯業律師事務所 31325
• 代理人: 王函

1.一種細粒棘球絳蟲原頭節源和囊液源外泌體非編碼RNA表達譜分析方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)細粒棘球絳蟲原頭節和囊液分離；

(2)細粒棘球絳蟲原頭節體外培養；

(3)細粒棘球絳蟲原頭節和囊液源外泌體分離，獲得原頭節源外泌體PSC-ELVs和囊液源外泌體HF-ELVs；

(4)透射電鏡分析；

(5)納米粒徑跟蹤分析；

(6)Western blotting；

(7)miRNA文庫構建及測序；

(8)全轉錄組測序文庫構建及測序分析；

(9)ceRNA調控網絡構建。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)具體為：采集自然感染細粒棘球蚴的綿羊肝臟，消毒后，用注射器穿刺棘球蚴吸取囊液，置于離心管自然沉降后，將上清轉移至新的離心管，收集囊液；沉淀清洗，收集原頭節。

3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)具體為：將步驟(1)分離的原頭節重懸于RPMI 1640完全培養基中，接種于T75的細胞培養瓶中，加入抗生素和葡萄糖置于37℃，5％CO₂培養箱；每12h收集一次原頭節培養上清并更換新的培養基，并吸取部分原頭節懸液，用1％臺盼藍染色計數判斷其活性；將原頭節在無血清培養基中培養7d，收集培養上清，-80℃保存。

4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)具體為：將收集的原頭節培養上清和囊液分別置于離心管內，依次離心，去除大的死細胞和細胞碎片，過濾上清液；將過濾后的原頭節培養上清和囊液，超速離心；沉淀用PBS洗滌，并以相同的速度進一步超離心純化；最后將獲得的原頭節源外泌體PSC-ELVs和囊液源外泌體HF-ELVs分別重懸于PBS中，并保存在-80℃下直至使用。

5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(4)具體為：吸取純化的PSC-ELVs和HF-ELVs懸浮液，滴加于銅網上，室溫靜置吸附1min，濾紙吸去殘液后滴加適量的3％磷鎢酸于銅網上，負染1min，室溫干燥；透射電子顯微鏡，80kV下曝光以捕獲圖像。

6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(5)具體為：用NanoSight LM10對外泌體進行納米粒徑跟蹤分析，以確定PSC-ELVs和HF-ELVs的粒徑大小和頻率分布。

7.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(6)具體為：將ELV沉淀與5×SDS和1×PBS混合，100℃煮沸；取蛋白質樣品在10％SDS-PAGE凝膠上分離，然后將蛋白質轉移至聚偏二氟乙烯膜；含5％牛血清白蛋白的TBS-0.05％Tween 20中封閉1h，將膜與以下兔多克隆抗體，4℃過夜：抗14-3-3zeta/delta，抗烯醇酶和抗CD9抗體；然后用HRP偶聯的山羊抗兔抗體，1：5 000，室溫孵育30min；ECL蛋白質印跡檢測系統對膜進行可視化檢測。

8.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(7)具體包括如下：使用TruSeq SmallRNA Sample Prep Kits進行文庫構建，包括連接3’接頭、連接5’接頭、逆轉錄與擴增、PCR擴增、cDNA純化、文庫質檢、測序、small RNA測序生物信息學分析、靶基因預測和KEGG信號通路分析；從miRNA文庫中篩選獲得的含量前20的miRNAs，具體序列見表2.3：

表2.3 PSC-ELVs和HF-ELVs中含量前20的miRNAs