[發明專利]一種基因編輯的載體和方法

有效

• 申請號: 202010588027.2
• 申請日: 2020-06-24
• 公開（公告）號: CN111850034B
• 公開（公告）日: 2023-01-10
• 發明（設計）人: 陳其軍;逯敏慧;姜媛媛;柴一萍
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/62;A01H5/00;A01H6/46
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司 11246
• 代理人: 陳波

本發明公開了基因工程技術領域的一種基因編輯的載體和方法。所述載體通過增加pegRNA表達框數量，使用聚合酶II和聚合酶III啟動子共同驅動pegRNA，并結合tRNA和RNA核酶的表達策略構建而成，使用本發明的載體，進行基因編輯，尤其是植物基因編輯，可以顯著提高先導編輯的效率，提高精準編輯效率。

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種基因編輯的載體和方法。

背景技術

精確的基因組編輯技術在作物育種和基因組功能研究中發揮著重要作用。盡管近年來基因編輯技術取得迅速進展，但精確編輯在植物中仍面臨巨大挑戰。最近，先導編輯系統(Prime Editing)在哺乳動物細胞中被開發和測試(Anzalone,Randolph et al.Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA 2019)。第一代先導編輯系統(PE1)由野生型逆轉錄酶(M-MLV)和Cas9切口酶(H840A)的融合蛋白以及先導編輯引導RNA(pegRNA)兩部分組成，其中先導編輯引導RNA由單鏈引導RNA(sgRNA)在其3’末端增加一段含有新遺傳信息的逆轉錄模板(rtT)和引物結合位點(PBS)的序列獲得；在PE1系統的基礎上，優化M-MLV逆轉錄酶建立PE2系統；在PE2系統的基礎上，引入切割非編輯鏈的sgRNA建立PE3和PE3b系統，其效率有明顯提升。動物細胞中，PE系統在不引入雙鏈斷裂(DSB)和無需供體DNA模板情況下，可有效實現12種單堿基的自由轉換和多堿基的精準插入與刪除。

2020年3月以來，國內已有多組科研團隊相繼發表文章闡述該先導編輯系統在植物水稻中的應用。結果表明，在植物中原始PE系統確實可以實現各種類型的精準編輯，也可以獲得具有目標編輯的轉基因材料，但其編輯效率卻遠不如哺乳動物細胞(Lin,Zong etal.2020)。因此，需要在植物(尤其對于遺傳轉化較難的物種)中開發出一種能顯著提高先導編輯效率的方法，以提高該系統的可用性和友好度。

發明內容

為了克服現有技術中的問題，本發明的目的之一在于提供一種基因編輯的載體。

所述基因編輯的載體包括：先導編輯系統，所述先導編輯系統包括針對特定編輯位點的pegRNA系統和PE融合蛋白基因，所述PE融合蛋白基因由Cas9基因和逆轉錄酶基因融合而成，所述針對特定編輯位點的pegRNA系統包括針對至少一個特定編輯位點的pegRNA基因，所述每個pegRNA基因至少設置2個表達框進行重復表達。

上述載體中，所述PE融合蛋白基因中：所述Cas9基因，優選的，為SpCas9切口酶(H840A)基因或者優化的SpCas9切口酶(H840A)基因，所述逆轉錄酶為鼠白血病病毒M_MLV逆轉錄酶或優化的鼠白血病病毒M_MLV逆轉錄酶；

例如，所述PE融合蛋白基因的序列為序列表中SEQ NO.1所示的核苷酸序列第2006位～第8359位；其中Cas9為密碼子優化的SpCas9切口酶(H840A)，位于SEQ NO.1所示的核苷酸序列的第2063位～第6163位；逆轉錄酶為優化的鼠白血病病毒M_MLV逆轉錄酶，位于第6263位～第8293位。

上述載體中，每個所述pegRNA基因的至少一個所述表達框由雙啟動子驅動，進一步的，所述雙啟動子為聚合酶II和聚合酶III啟動子共同驅動。

例如，所述聚合酶II和聚合酶III啟動子為CmYLCV啟動子(Cestrum yellow leafcurling virus，夜香樹黃曲葉病毒)和U6-26啟動子(已去除其5’端的潛在終止子序列，可稱之為U6啟動子)；

例如，所述聚合酶II和聚合酶III啟動子為ZmUbi1和OsU3。