[發(fā)明專(zhuān)利]通過(guò)CTRP6介導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣化動(dòng)物模型及其建立方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010584843.6
• 申請(qǐng)日: 2020-06-24
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111778284B
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-09-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 關(guān)華;李向宇;余琦;張?jiān)奇?/a>
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 西安醫(yī)學(xué)院
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/861
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/861;C12N15/66;A01K67/027
• 代理公司: 西安弘理專(zhuān)利事務(wù)所 61214
• 代理人: 寧文濤

1.一種通過(guò)CTRP6介導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型的建立方法，其特征在于，按照以下步驟進(jìn)行：

步驟1、構(gòu)建腺病毒表達(dá)載體Ad-CTRP6；

腺病毒表達(dá)載體具體構(gòu)建步驟如下：

步驟1.1、采用HindⅢ、SalⅠ雙酶切小鼠CTRP6?cDNA質(zhì)粒，電洗脫回收CTRP6?cDNA片段，HindⅢ、SalⅠ雙酶切pCMV-CTRP6質(zhì)粒，電洗脫法回收pAdTrack-CMV?HindⅢ和SalⅠ雙酶切線性片段，再通過(guò)T4DNA連接酶連接CTRP6?cDNA?片段與pAdTrack-CMV?HindⅢ、SalI雙酶切線性片段，將連接得到的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)Kan+LB培養(yǎng)基培養(yǎng)后采用堿裂解法提取重組質(zhì)粒；

步驟1.2、將步驟1.1所得的pAdTrack-CTRP6重組質(zhì)粒經(jīng)PemⅠ酶切，電洗脫回收線性片段，將酶切后的pAdTrack-CTRP6?PemⅠ酶切線性片段電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)入含pAdEasy-1的E.coliBJ5183電感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物經(jīng)Kan+LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)后采用堿性裂解法提取pAdEasy-CTRP6重組質(zhì)粒；

步驟1.3、采用PacⅠ酶切步驟1.2所得的pAdEasy-CTRP6得到Pac?I線性化重組質(zhì)粒pAdEasy-CTRP6片段，采用5μg的?Pac?Ⅰ線性化重組質(zhì)粒p?AdEasy-CTRP6片段轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)細(xì)胞7～10天，每天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)及綠色熒光蛋白表達(dá)，當(dāng)細(xì)胞中綠色熒光蛋白表達(dá)呈“彗星”狀并出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)時(shí)，收集HEK293細(xì)胞并渦旋震蕩4次使細(xì)胞裂解，裂解后在12000r/min的條件下離心3?min，收集上清液即為Ad-CTRP6病毒液，將Ad-CTRP6病毒液于-80℃保存?zhèn)溆茫?/p>

步驟1.4、感染當(dāng)天，將200μL所述步驟1.3得到的Ad-CTRP6病毒液加至1.5?mL?DEME完全培養(yǎng)液中培養(yǎng)90min后，加入3.5?mLDMEM完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，感染第3天，細(xì)胞出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變效應(yīng)并伴有脫落時(shí)，收集病毒，再重復(fù)感染Ad-CTRP6病毒液4次，將所得的病毒總和進(jìn)行收集即為腺病毒表達(dá)載體Ad-CTRP6；

步驟2、將步驟1得到的所述腺病毒載體Ad-CTRP6通過(guò)尾部靜脈注射到ApoE^-/-小鼠中，注射后采用高脂飼料喂養(yǎng)6周，第四周時(shí)再注射一次腺病毒表達(dá)載體Ad-CTRP6，6周后得到的小鼠即得到動(dòng)物模型。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種通過(guò)CTRP6介導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型的建立方法，其特征在于，所述步驟1.3中轉(zhuǎn)染前1天將HEK293細(xì)胞于直徑為60mm的培養(yǎng)皿培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞的細(xì)胞密度30%-50%。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種通過(guò)CTRP6介導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型的建立方法，其特征在于，所述步驟1.4中感染前1天，將HEK293細(xì)胞于直徑為100mm的培養(yǎng)皿，感染時(shí)細(xì)胞密度75%-85%。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種通過(guò)CTRP6介導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型的建立方法，其特征在于，所述步驟2中高脂飼料的膽固醇和脂肪量為1.5%?cholesterol?+?15%?fat。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種通過(guò)CTRP6介導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型的建立方法，其特征在于，所述步驟2中注射入ApoE^-/-小鼠的腺病毒表達(dá)載體Ad-CTRP6的濃度是1×10¹¹vp/mL。