[發明專利]一種小鼠動脈粥樣硬化動物模型及其建立方法

在審

• 申請號: 202010584396.4
• 申請日: 2020-06-24
• 公開（公告）號: CN111808883A
• 公開（公告）日: 2020-10-23
• 發明（設計）人: 余琦;張云婷
• 申請（專利權）人: 西安醫學院
• 主分類號: C12N15/861
• 分類號: C12N15/861;C12N15/66;A01K67/027
• 代理公司: 西安弘理專利事務所 61214
• 代理人: 寧文濤

1.一種小鼠動脈粥樣硬化動物模型，其特征在于，所述動物模型通過腺病毒系統性高表達可誘導小鼠低密度脂蛋白受體降解蛋白的表達得到。

2.一種權利要求1所述的一種小鼠動脈粥樣硬化動物模型的建立方法，其特征在于，按照以下步驟進行：

步驟1、構建腺病毒表達載體Ad-IDOL；

步驟2、將步驟1得到的所述腺病毒載體通過尾部靜脈注射到ApoE^-/-小鼠中，注射后采用高脂飼料喂養6周，第四周時再注射一次步驟1.5的腺病毒表達載體Ad-IDOL，6周后得到的小鼠即得到本發明的一種小鼠動脈粥樣硬化動物模型。

3.根據權利要求2所述的一種小鼠動脈粥樣硬化動物模型的建立方法，其特征在于，所述步驟1中腺病毒表達載體具體構建步驟如下：

步驟1.1、采用Hind Ⅲ、SalⅠ雙酶切IDOL cDNA質粒，電洗脫回收IDOL cDNA片段，HindⅢ、Sal Ⅰ雙酶切p IDOL-CMV質粒，電洗脫法回收p AdTrack-CMV Hind Ⅲ和Sal Ⅰ雙酶切線性片段，再通過T4DNA連接酶連接IDOL cDNA片段與p AdTrack-CMV Hind Ⅲ、Sal I雙酶切線性片段，將連接得到的產物轉化到E.coliDH5α感受態細胞中，經Kan⁺LB培養基培養后采用堿裂解法提取重組質粒；

步驟1.2、將步驟1.1所得的p AdTrack-IDOL重組質粒經Pem Ⅰ酶切，電洗脫回收線性片段，將酶切后的p AdTrack-IDOL Pem Ⅰ酶切線性片段電轉法轉入含p AdEasy-1的E.coliBJ5183電感受態細胞，轉化產物經Kan⁺LB固體培養基培養后采用堿性裂解法提取pAdEasy-IDOL重組質粒；

步驟1.3、采用Pac Ⅰ酶切步驟1.2所得的p AdEasy-IDOL得到Pac I線性化重組質粒pAdEasy-IDOL片段，采用5μg的Pac Ⅰ線性化重組質粒p AdEasy-IDOL片段轉染HEK293細胞，轉染后培養HEK293細胞7～10天，每天觀察HEK293細胞生長及HEK293細胞中綠色熒光蛋白出現的情況，當HEK293細胞中綠色熒光蛋白表達呈“彗星”狀并出現細胞病變效應時，收集HEK293細胞并渦旋震蕩4次使細胞裂解，裂解后在12000r/min的條件下離心3min，收集上清液即為AD-IDOL病毒液，將AD-IDOL病毒液于-80℃保存備用；

步驟1.4、感染當天，將200μL所述步驟1.3得到的AD-IDOL病毒液加至1.5mL DEME完全培養液中培養90min后，加入3.5mL的DMEM完全培養液培養，感染第3天，細胞出現明顯細胞病變效應并伴有脫落時，收集病毒，再重復感染AD-IDOL病毒液4次，將所得的病毒總和進行收集即為本發明的腺病毒表達載體Ad-IDOL。

4.根據權利要求3所述的一種小鼠動脈粥樣硬化動物模型的建立方法，其特征在于，所述步驟1.3中轉染前1天將HEK293細胞于直徑為60mm的培養皿培養，轉染時HEK293細胞的細胞密度30％-50％。

5.根據權利要求3所述的一種小鼠動脈粥樣硬化動物模型的建立方法，其特征在于，所述步驟1.4中感染前1天，將HEK293細胞于直徑為100mm的培養皿，感染時HEK293細胞的細胞密度75％-85％。

6.根據權利要求2所述的一種小鼠動脈粥樣硬化動物模型的建立方法，其特征在于，所述步驟2中高脂飼料的膽固醇和脂肪量為1.5％cholesterol+15％fat。

7.根據權利要求2所述的一種小鼠動脈粥樣硬化動物模型的建立方法，其特征在于，所述步驟2中注射入ApoE^-/-小鼠的腺病毒表達載體Ad-IDOL的濃度是1×10¹¹vp/mL。