[發明專利]一種特異識別副溶血性弧菌TDH的核酸適配體TDHA的序列和應用

有效

• 申請號: 202010583135.0
• 申請日: 2020-06-23
• 公開（公告）號: CN111690648B
• 公開（公告）日: 2022-06-28
• 發明（設計）人: 吳冬;王開宇
• 申請（專利權）人: 麗水君弘生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;G01N33/569
• 代理公司: 福州創蔚來知識產權代理有限公司 35290
• 代理人: 鄭艷艷

本發明涉及一種特異識別副溶血性弧菌TDH的核酸適配體TDHA的序列及其應用，該核酸適配體TDHA的序列為：5'?GAGCGGCACGAACCAGTAAAGTCTTCCCGACCGC?3'；本發明的核酸適配體TDHA能高親和力、高特異性地識別副溶血性弧菌TDH；以核酸適配體TDHA作為副溶血性弧菌TDH的識別元件，建立副溶血性弧菌TDH的檢測方法和制備檢測試劑，可用于環境中副溶血性弧菌污染的監測，臨床中副溶血弧菌感染的診斷、病情評估，以及基礎研究中副溶血性弧菌TDH的生物學功能分析等應用領域，具有方法簡便、快速、特性好等優點。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種特異識別TDH的核酸適配體TDHA的序列及其在檢測副溶血性弧菌TDH方面的應用。

背景技術

副溶血性弧菌（Vibrio Parahaemolyticus），為革蘭氏陰性桿菌，呈弧狀、桿狀、絲狀等多種形狀，無芽孢。進食含有該菌的食物可致食物中毒，也稱嗜鹽菌食物中毒。副溶血性弧菌引起的食物中毒經烹飪不當的海產品或鹽腌制品傳播。常見的為海蜇、海魚、海蝦及各種貝類。因食物容器或砧板生熟不分污染本菌后，也可發生食物中毒。該病常年均可發生，潛伏期5-72小時，平均24小時，臨床表現可從自限性腹瀉至中度霍亂樣病癥，有腹瀉、腹痛、嘔吐和低熱等癥狀。糞便多為水樣，少數為血水樣，恢復較快，病后免疫力不強，可重復感染。

溶血素是副溶血性弧菌致病的最主要原因，包括耐熱直接溶血素（ThermostableDirect Hemolysin，TDH）、耐熱直接溶血素相關溶血素（TDH-related hemolysin，TRH）和不耐熱溶血素（Thermolabile Hemolysin，TLH）。流行病學調查研究表明TDH是副溶血性弧菌最主要致病因子，臨床上分離出的副溶血性弧菌幾乎95%以上都會在特殊的血平板上產生溶血環，被稱作神奈川現象（Kangawa Phenomenon，KP）。目前，國內外針對副溶血性弧菌TDH的檢測研究大多數采用的是分子生物學技術，其中以多重PCR、熒光實時定量PCR等的運用較多。雖然直接檢測副溶血性弧菌TDH更加方便、快捷，但由于抗體特異性問題，只有極少數的免疫學技術應用于這方面。

核酸適配體（Aptamer）是一段寡核苷酸序列（DNA或RNA）。 通常是利用體外篩選技術——指數富集的配體系統進化技術（Systematic evolution of ligands byexponential enrichment，SELEX），從核酸分子隨機文庫中得到的寡核苷酸片段。核酸適配體與靶標的結合具有高親和力、高特異性等特點。作為核酸類分子，核酸適配體可直接合成并進行各種化學修飾，具有成本低、制備快等優點。將核酸適配體作為靶標的識別元件，已應用于各種靶標的快速、準確檢測。已有研究將核酸適配體作為副溶血性弧菌的識別元件，建立了可檢測副溶血性弧菌菌體的傳感器檢測方法（J Agric Food Chem。2019，67：2313-2320）。如能利用核酸適配體的優勢，建立快速、準確的副溶血性弧菌TDH檢測方法，將具有廣闊的應用和基礎研究價值。

本發明提出一種特異識別副溶血性弧菌TDH的核酸適配體TDHA。TDHA是以大腸桿菌表達的副溶血性弧菌TDH為靶標，通過SELEX技術從體外人工篩選并經序列優化后獲得。TDHA能夠特異識別TDH，而不結合其他副溶血性弧菌的溶血素。目前尚未見以特異性核酸適配體為識別元件，建立副溶血性弧菌TDH檢測試劑盒的報道。發明內容

本發明目的在于提出一種特異識別副溶血性弧菌TDH的核酸適配體TDHA的序列及其應用，包括將TDHA作為TDH的識別元件，建立副溶血性弧菌TDH檢測試劑盒，用于副溶血性弧菌TDH污染的監測，以及副溶血性弧菌感染病情的診斷、預測和監控等。

本發明通過以下技術方案實現：

首先由上海生工公司合成核酸適配體TDHA序列，并在TDHA的5’端或3’端進行修飾、標記（如生物素或者熒光基團），然后進行應用研究：以TDHA為識別元件，分別建立可用于檢測副溶血性弧菌TDH的比色法生物傳感器、凝膠遷移阻滯實驗、酶聯適配體吸附法。