[發(fā)明專利]抗根癌病的靶基因片段及其干擾載體和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010581367.2
• 申請日: 2020-06-23
• 公開（公告）號: CN111733171B
• 公開（公告）日: 2022-02-25
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 齊希梁;李明;劉聰利;宋露露
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所
• 主分類號: C12N15/55
• 分類號: C12N15/55;C12N15/54;C12N15/53;C12N15/82;A01H5/00;A01H6/74
• 代理公司: 北京思元知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11598
• 代理人: 余光軍;霍雪梅

本發(fā)明公開了抗根癌病的靶基因片段及其干擾載體和應(yīng)用。本發(fā)明通過病毒誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù)將18段櫻桃根瘤病菌的iaaM、iaaH和ipt的靶標片段及其基因融合靶標片段導(dǎo)入櫻桃砧木‘ZY?1’中，發(fā)現(xiàn)導(dǎo)入18段靶基因片段的櫻桃砧木的抗病性都顯著提高，其中有5段靶標片段的抗病性極顯著提高，達到高抗水平以上甚至免疫；本發(fā)明進一步將這5段靶基因序列構(gòu)建穩(wěn)定遺傳干擾載體轉(zhuǎn)化櫻桃砧木，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因櫻桃植物對根癌土壤桿菌抗病性顯著增強，達到高抗水平以上。應(yīng)用本發(fā)明所提供的抗根癌病的靶基因片段能夠提高果樹對根癌病的抗性或進一步培育獲得抗根癌病的果樹新種質(zhì)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及抗根癌病的靶基因片段，本發(fā)明進一步涉及含有這些靶基因片段的干擾載體以及在提高果樹對根癌土壤桿菌抗性中的應(yīng)用，屬于抗根癌病的靶基因片段及其應(yīng)用領(lǐng)域。

背景技術(shù)

歐洲甜櫻桃(Prunus avium.L)屬于薔薇科，李亞科，櫻屬果樹植物，是目前北方落葉果樹中栽培效益最好的樹種之一，也是中國北方春季上市最早的鮮果。目前中國的甜櫻桃栽培面積和產(chǎn)量已達世界第一。盡管中國甜櫻桃產(chǎn)業(yè)取得可喜的成績，但生產(chǎn)中仍存在許多問題，如櫻桃根癌病等問題，嚴重威脅著中國櫻桃產(chǎn)業(yè)(張開春.等中國甜櫻桃的栽培歷史、生產(chǎn)現(xiàn)狀及發(fā)展建議.落葉果樹,2017,49(06):1-5.)。

櫻桃根癌病，又稱冠癭病，是由根癌土壤桿菌屬(Agrobacterium spp.)中的致病菌引起的一種細菌性病害，可侵染多種高等植物(馬德欽等.果樹根癌病及其生物防治.中國果樹,1995,2(5):42-44.)。根癌土壤桿菌可從植株傷口侵入，有寄主組織存在的情況下，細菌并不進入寄主植物細胞，只是把Ti質(zhì)粒的T-DNA片段導(dǎo)入植物細胞基因組中，在T-DNA上包含數(shù)個誘發(fā)腫瘤的關(guān)鍵基因，如生長素合成中關(guān)鍵酶色氨酸單加氧酶基因(iaaM)、吲哚乙酰胺水解酶基因(iaaH)以及細胞分裂素合成過程中的關(guān)鍵酶異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因(ipt)等，若細胞分裂素和生長素過量表達，使被侵染轉(zhuǎn)化植株的細胞內(nèi)源激素平衡紊亂，冠癭瘤細胞無限增殖，轉(zhuǎn)化為腫瘤狀態(tài)，引起癌變，干擾了樹體正常養(yǎng)分和水分供應(yīng)，導(dǎo)致樹體衰弱或死亡。由于該病發(fā)病率高、傳播速度快，嚴重時可導(dǎo)致全園感病，對中國櫻桃產(chǎn)業(yè)造成嚴重的危害(Gohlke J,Deeken R.Plant responses to Agrobacteriumtumefaciens and crown gall development.Frontiers in Plant Science,2014,5:155.)。因此，對威脅櫻桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展的根癌病進行深入研究和有效地防治勢在必行。選用抗病品種或砧木以及提高砧木的抗病性是防治櫻桃根癌病的一個重要途徑，而抗病品種或砧木的選育周期長，因此，利用生物技術(shù)等手段提高已有砧木品種的抗病性是一種快速而有效的手段。

寄主誘導(dǎo)的基因沉默(HIGS)是在病毒誘導(dǎo)的基因沉默(VIGS)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來，也是轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGS)-RNA沉默的一種表現(xiàn)(Baulcombe DC.VIGS,HIGS and FIGS:small RNA silencing in the interactions of viruses or filamentous organismswith their plant hosts.Current Opinion in Plant Biology,2015,141-146.)。將病原菌的特定基因通過病毒載體或含有雙啟動子的目的基因片段反義發(fā)夾結(jié)構(gòu)載體轉(zhuǎn)染到寄主植物中，導(dǎo)致病原物產(chǎn)生特定序列的雙鏈RNA(dsRNA)。當病原物攻擊表達HIGS結(jié)構(gòu)的寄主時，病原菌中的目的基因會下調(diào)，亦即通過RNAi結(jié)構(gòu)對在寄主植物中的病原菌內(nèi)源性基因的表達進行干擾，最終沉默植物病原菌的基因(Nunes and Dean,2012；Yin andHulbert,2018)。HIGS作為一種快速簡便、通用性強、靶向性高的新技術(shù)克服了以前基因功能研究方法的不足，將在植物專性寄生菌基因功能研究中顯示出其強大的優(yōu)勢(肖瑤等.寄主誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù)研究和應(yīng)用進展.植物保護學(xué)報,2020,47(01):11-17.)。