[發明專利]一種生產原兒茶酸的大腸桿菌工程菌構建方法及應用

有效

• 申請號: 202010581182.1
• 申請日: 2020-06-23
• 公開（公告）號: CN111647616B
• 公開（公告）日: 2022-05-03
• 發明（設計）人: 袁吉鋒;陳玉芬
• 申請（專利權）人: 廈門大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N1/21;C12P7/42;C12R1/19
• 代理公司: 廈門創象知識產權代理有限公司 35232
• 代理人: 王鳳玲;尤懷成

1.一種生產原兒茶酸的大腸桿菌工程菌構建方法，其特征在于，包括以下步驟：

PCR擴增獲取PmLAAD、HmaS、HMO、BFD、HFD1、PobA六種基因，將PmLAAD和HmaS基因雙片段、HMO和BFD基因雙片段用BsaI酶切，隨后分別連接進入經BamHI和XhoI雙酶切的表達載體pETDuet-1、pCDFDuet-1，得到質粒pET-PmLAAD-HmaS和質粒pCDF-HMO-BFD；將HFD1酶切后，連接進入表達載體pRSFDuet-1中得到質粒pRSF-HFD1；將PobA基因單片段酶切，連接經BamHI和XhoI雙酶切的pACYCDuet-1載體，獲得質粒pACYC-PobA；其中，PmLAAD基因是以核苷酸序列為SEQ ID No:17的合成PmLAAD基因為模板，以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 2所示序列為引物進行PCR擴增；HmaS基因是以核苷酸序列為SEQ ID No:18的合成HmaS基因為模板，以SEQ ID NO:03和SEQ ID NO:04所示序列為引物進行PCR擴增；BFD基因是以天藍鏈霉菌M145基因組為模板，以SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 6所示序列為引物進行PCR擴增；HMO基因是以惡臭假單胞菌KT2440基因組為模板，以SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10所示序列為引物進行PCR擴增；HFD1基因是以釀酒酵母BY4741基因組為模板，以SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示序列為引物進行PCR擴增；PobA基因是以惡臭假單胞菌KT2440基因組為模板，以SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示序列為引物進行PCR擴增；

將質粒pET-PmLAAD-HmaS、質粒pCDF-HMO-BFD、質粒pRSF-HFD1和質粒pACYC-PobA共同轉入大腸桿菌MG1655 RARE感受態細胞中，得到重組大腸桿菌工程菌MG1655-PCA2。

2.權利要求1所述的方法構建的生產原兒茶酸的大腸桿菌工程菌。

3.權利要求2所述的大腸桿菌工程菌用于生產原兒茶酸的用途。

4.一種使用權利要求2所述的大腸桿菌工程菌生產原兒茶酸的方法，其特征在于，包括以下步驟：

將重組大腸桿菌工程菌進行活化和擴大培養，先接種于LB培養基中，之后按1:100比例將過夜培養物轉接入TB培養液中培養，然后加入誘導劑進行誘導培養，離心收集細胞；

采用10 g/L新鮮細胞干重，5 mM L-酪氨酸底物，20 g/L葡萄糖，磷酸鹽緩沖液反應體系，在30℃，250 rpm下催化1~12 h，每隔兩小時液相色譜檢測原兒茶酸產量。