[發(fā)明專利]一種提高甘草懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中甘草酸含量的培養(yǎng)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010578727.3
• 申請(qǐng)日: 2020-06-23
• 公開（公告）號(hào): CN111718888B
• 公開（公告）日: 2022-08-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳彩霞;李先恩;王文全
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所
• 主分類號(hào): C12N5/04
• 分類號(hào): C12N5/04;C12N5/02;C12P33/20;A01G22/40;A01H4/00
• 代理公司: 北京迎碩知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11512
• 代理人: 張群峰

本發(fā)明公開了一種提高甘草懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中甘草酸含量的培養(yǎng)方法，包括獲得甘草無菌苗、誘導(dǎo)愈傷組織、建立甘草細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系、誘導(dǎo)懸浮培養(yǎng)體系細(xì)胞中甘草酸積累的培養(yǎng)步驟，通過在誘導(dǎo)懸浮培養(yǎng)體系細(xì)胞中甘草酸積累培養(yǎng)過程的第8?10天，補(bǔ)充添加蔗糖，在培養(yǎng)末期，加入茉莉酸甲酯，誘導(dǎo)甘草酸積累使其含量增加，在保證甘草懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生物量穩(wěn)定的基礎(chǔ)上，甘草酸產(chǎn)量與以往方法相比提高近10倍，且能夠持續(xù)、高效、穩(wěn)定、快速地獲得大量甘草酸含量較高的甘草懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，不受季節(jié)及自然生態(tài)條件的限制，可大規(guī)模培養(yǎng)甘草細(xì)胞生產(chǎn)甘草酸，具有廣闊的應(yīng)用前景和顯著的社會(huì)、經(jīng)濟(jì)效益。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種細(xì)胞培養(yǎng)方法，具體涉及一種提高甘草懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中甘草酸含量的培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)

甘草酸是甘草中最重要的活性成分，具有抗炎、抗?jié)儭⒖共《竞兔庖哒{(diào)節(jié)等多種藥理活性。另有報(bào)道甘草酸具有抗SARS病毒的作用，并且能夠增強(qiáng)SARS感染者的免疫力。分離提純技術(shù)的更新將甘草酸的應(yīng)用逐漸推向現(xiàn)代化，最新一代的甘草制劑甘草酸二銨腸溶膠囊是獲兩項(xiàng)國家發(fā)明專利具有獨(dú)特制劑優(yōu)勢的藥物，是各種肝臟炎癥的特異性治療藥物。同時(shí),由于甘草酸的甜度是蔗糖的150倍,它也是用途很廣泛的甜味劑，其相關(guān)出口產(chǎn)品年銷量可達(dá)4千萬美元,市場需求量大。

植物器官和體外組織培養(yǎng)已成為獲得植物次級(jí)代謝產(chǎn)物的重要替代源。細(xì)胞懸浮培養(yǎng)是植物細(xì)胞生長的微生物化,具有細(xì)胞分散性好,生產(chǎn)迅速、易于控制、節(jié)約土地等優(yōu)勢,成為解決目前藥用植物資源危機(jī)的理想途徑之一。

CN200810053014.4公開了一種甘草細(xì)胞產(chǎn)業(yè)化培養(yǎng)方法，目標(biāo)產(chǎn)物是細(xì)胞生物量，關(guān)注點(diǎn)不在有效成分含量。CN201610727559.3公開了一種可提高甘草黃酮含量的光果甘草愈傷組織細(xì)胞培養(yǎng)方法，得到的是甘草黃酮含量高的甘草愈傷組織細(xì)胞，目標(biāo)產(chǎn)物是甘草黃酮。CN 201110255311.9公開了一種利用組織培養(yǎng)方法生產(chǎn)甘草多糖的方法，目標(biāo)產(chǎn)物是細(xì)胞中甘草多糖的含量。

目前對(duì)于甘草細(xì)胞培養(yǎng)物能否產(chǎn)生甘草酸一直存在爭議。已有研究表明，甘草細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)量很低，完全不能滿足細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)生產(chǎn)甘草酸的要求。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決現(xiàn)有技術(shù)中甘草細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)量低，不能滿足細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)生產(chǎn)甘草酸的需求，本發(fā)明以甘草酸含量和細(xì)胞生物量為篩選條件，專門進(jìn)行了刺激甘草酸生物合成積累增加的誘導(dǎo)研究，篩選出了一種提高甘草懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中甘草酸含量的培養(yǎng)方法。采用的技術(shù)方案包括如下步驟：

(1)獲得甘草無菌苗選用籽粒飽滿的甘草種子，用濃硫酸腐蝕處理30-60分鐘后，用清水沖洗干凈，再用質(zhì)量濃度為75％的乙醇表面消毒30s，無菌水洗滌2次，然后在1-3％的次氯酸鈉溶液中浸泡10-20min，浸泡期間充分搖晃，之后再用無菌水洗滌3-5次，每次不少于1min；將洗滌好的種子接種到添加30g.L^-1蔗糖、6g.L^-1瓊脂的MS基本培養(yǎng)基中，pH值6.0，在溫度25℃±2℃，光照強(qiáng)度2000-4000Lux，光照時(shí)間16h/d的光照條件下培養(yǎng)25-30d，種子萌發(fā)生長，下胚軸長至2-3cm，子葉展開即可獲得甘草無菌苗；

(2)誘導(dǎo)愈傷組織選取步驟(1)中正常茁壯生長的甘草無菌苗，將下胚軸切段、子葉切塊，接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上；在溫度為25℃±2℃的無菌條件下黑暗培養(yǎng)25-30d，完成繼代培養(yǎng)一次，獲得甘草愈傷組織；所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：以MS為基本培養(yǎng)基，添加0.5-1mg.L^-1萘乙酸、0.5-2mg.L^-1 6-芐氨基嘌呤、0.2-1.0mg.L^-1 2，4-二氯苯氧乙酸、25-30g.L^-1蔗糖及5-6g.L^-1瓊脂，pH值5.5-6.0；