[發明專利]一種利用大腸桿菌全生物合成丙二酸的方法

有效

• 申請號: 202010577670.5
• 申請日: 2020-06-23
• 公開（公告）號: CN113832087B
• 公開（公告）日: 2023-09-12
• 發明（設計）人: 鄧禹;趙運英;張祺玥;付雯宣;許銘清;劉源;趙潤芝;朱桐江
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12N15/60;C12N15/54;C12N15/53;C12P7/46;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 仇鈺瑩

本發明公開了一種利用大腸桿菌全生物合成丙二酸的方法，屬于生物工程領域。本發明是以大腸桿菌BL21(DE3)為宿主，將大腸桿菌自身的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因和天冬氨酸轉氨酶共表達，將來自谷氨酸棒桿菌的天冬氨酸?α?脫氫酶基因單獨進行表達，將大腸桿菌自身的琥珀酸半醛脫氫酶基因和來自銅綠假單胞菌的異源基因β?丙氨酸丙酮酸轉氨酶基因共表達，構建了經由草酰乙酸?天冬氨酸的丙二酸全生物合成途徑，使工程菌積累丙二酸的能力進一步提高，發酵36小時丙二酸產量可達0.74g/L，較前期構建菌株丙二酸最高產量0.23g/L提高了3倍，發酵時間提前了12小時。

技術領域

本發明涉及一種利用大腸桿菌全生物合成丙二酸的方法，屬于生物工程領域。

背景技術

丙二酸主要用于香料、膠粘劑和樹脂添加劑等的生產，也可用于皮革制品或鋁制品表面處理劑、泡沫塑料發泡劑和核反應器的化學清洗劑，如丙二酸是生產農藥殺菌劑富士一號、除草劑枯殺達、植物生長調節劑吲熟酯的原料；醫藥行業使用丙二酸制備利尿藥苯磺唑酮、抗炎藥羥苯保泰松、鎮靜藥溴甲辛托品等；丙二酸加熱后生成二氧化碳和水，沒有污染問題，所以可直接用作鋁表面處理劑。此外，丙二酸及其酯類也可廣泛應用作醫藥中間體，丙二酸的兩個羧基中的羥基全被乙氧基取代而生成的化合物丙二酸二乙酯或丙二酸二乙酯是重要的有機合成原料，用于染料和藥物合成，如制造巴比妥類藥物，維生素B1和B6等。隨著目前國內和國際化工行業的快速發展，加上丙二酸的用途的大力開發，丙二酸的產量和品質在日劇上升。

丙二酸現在應用于實際生產中的主要合成方法為化學合成法。主要有兩種生產路線，一是丙二酸酯用硫酸在80-90℃水解，該法特點是工藝路線及生產周期短、三廢少，但該水解過程屬于可逆反應，且丙二酸受高溫容易發生脫羧反應分解生成乙酸、水和二氧化碳，故產品收率低，但該方法易控制雜質的產生，所以產品的純度較高；二是二是酯交換工藝，只要控制原料的純度，就可以制備含量高、雜質少、水份低的高純度丙二酸且得到的副產可以制備純度較高的乙酸乙酯，此法的缺點是：需要用到乙酸、有刺鼻酸味、另有副產乙酸乙醋和乙醇的混合溶液產生，不好處理。

丙二酸的生物合成途徑還沒有得到很好的發展，已知的方法是通過丙二酰-CoA水解酶活性從丙二酰-CoA產生丙二酸的方法(WO?2013134424)。但是，丙二酰-CoA途徑的代謝物生產效率比天冬氨酸途徑低，因此，利用天冬氨酸途徑生產丙二酸是一種效率更高的方法。

發明內容

針對上述問題，本發明的第一個目的是提供一種由草酰乙酸-天冬氨酸途徑生物合成丙二酸的重組大腸桿菌，所述大腸桿菌分模塊過量表達來自大腸桿菌的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，天冬氨酸轉氨酶，琥珀酸半醛脫氫酶，來自谷氨酸棒桿菌的異源基因天冬氨酸-α-脫氫酶和來自銅綠假單胞菌的異源基因β-丙氨酸丙酮酸轉氨酶。

在一種實施方式中，所述重組大腸桿菌以大腸桿菌BL21(DE3)為宿主。

在一種實施方式中，所述分模塊過量表達是將基因ppc和aspC共表達，將基因panD單獨表達，將基因yne1和pa0123共表達。

在一種實施方式中，所述大腸桿菌以大腸桿菌BL21(DE3)為宿主，分模塊過量表達來自大腸桿菌的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因(ppc)，天冬氨酸轉氨酶基因(aspC)，琥珀酸半醛脫氫酶基因(yne1)，來自谷氨酸棒桿菌的異源基因天冬氨酸-α-脫氫酶基因(panD)和來自銅綠假單胞菌的異源基因β-丙氨酸丙酮酸轉氨酶基因(pa0123)。

在一種實施方式中，所述磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因(ppc)的核苷酸序列如SEQID?NO.1所示；氨基酸序列如SEQ?ID?NO.7所示。

在一種實施方式中，所述天冬氨酸轉氨酶基因(aspC)的核苷酸序列如SEQ?IDNO.2所示；氨基酸序列如SEQ?ID?NO.8所示。

在一種實施方式中，所述天冬氨酸-α-脫氫酶基因(panD)的核苷酸序列如SEQ?IDNO.3所示；氨基酸序列如SEQ?ID?NO.9所示。