[發明專利]厚殼貽貝不同發育階段的熒光定量內參基因及其引物和應用

在審

• 申請號: 202010576937.9
• 申請日: 2020-06-23
• 公開（公告）號: CN111575390A
• 公開（公告）日: 2020-08-25
• 發明（設計）人: 李一峰;王林雨;梁簫;凌嵐馨;程之揚;楊金龍
• 申請（專利權）人: 上海海洋大學
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/6851;C12N15/11
• 代理公司: 上海伯瑞杰知識產權代理有限公司 31227
• 代理人: 范艷靜

本發明提供了一種厚殼貽貝不同發育階段的熒光定量內參基因及其引物和應用，厚殼貽貝不同發育階段的熒光定量內參基因為RPS23、CYTB5、EF?1α和α?Tubulin，RPS23基因的堿基序列如SEQ ID NO.1所示，CYTB5基因的堿基序列如SEQ ID NO.2所示，EF?1α基因的堿基序列如SEQ ID NO.3所示，α?Tubulin基因的堿基序列如SEQ ID NO.4所示；本發明從4個常用候選內參基因中篩選得到2個在不同發育階段中表達相對最穩定的內參基因，以應用于厚殼貽貝不同發育階段幼體的基因表達分析研究，從而為厚殼貽貝不同發育階段幼體實驗中功能基因表達的精確定量提供有力保證。

技術領域

本發明屬于分子生物學技術領域，具體涉及一種厚殼貽貝不同發育階段的熒光定量內參基因及其引物和應用。

背景技術

厚殼貽貝(Mytilus coruscus)隸屬軟體動物門雙殼綱貽貝目，是一種近海暖溫性的底棲貝類，是我國繼牡蠣、蛤和扇貝后的第四大海產貝類。貝類養殖不僅滿足消費者對于鮮活、優質海產品的需求，同時對國家藍色海洋可持續發展起著非常重要的作用。厚殼貽貝作為附著性貝類，幼體時期需要經歷一個附著和變態的過程，也是其從浮游幼蟲的生活方式轉變為底棲生活方式的重要轉變過程。幼體的變態過程主要由外界環境因子和內源性因子所控制，關于外界環境因子如海洋微生物被膜、海洋細菌被膜和人工誘導物等已有大量的研究報道。近年來，在分子水平闡明幼蟲變態發育的調控機制受到科學家們的廣泛關注。實時熒光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)是一種定量檢測目的基因表達的技術，可以捕捉到PCR擴增反應中每個循環產物產生的熒光信號，完成定性以及定量分析。與傳統的PCR技術相比，它具有高精確度、強特異性、快速檢測和重復性好等優點。

內參基因是指在對某一個目的基因進行定量研究時，在不同實驗條件下都能在待測樣品中實現穩定表達的一類基因，其作用是校正目的基因的定量過程。這些內參基因一般都是管家基因，在細胞內可以穩定表達，從而有助于細胞各種功能的實現。在進行qRT-PCR過程中，待測樣品可能會在反轉錄效率上存在差異，所以需要選擇可以穩定表達的內參基因作為校正標準。

公開號為CN104073557A的專利中，篩選出的β-actin、GAPDH和RS18是Poly(I:C)應激實驗中，牡蠣血細胞內表達最穩定的3個內參基因，因此可以同時使用做為熒光定量內參基因。此外，一些內參基因只在特定時期或處理條件下穩定表達。發育時期或處理條件不同，常用內參基因的表達就會產生巨大差異。因此，對于不同的實驗條件和樣本類型，需要不同的內參基因。

發明內容

針對現有技術中的不足，本發明的首要目的是提供一種厚殼貽貝不同發育階段的熒光定量內參基因，即篩選厚殼貽貝(Mytilus coruscus)不同生長發育階段的熒光定量內參基因?；跓晒舛縋CR中的絕對定量法在厚殼貽貝不同生長發育階段相關實驗中對其他功能基因進行定量分析所需的內參基因及其引物序列，從而篩選出穩定表達的內參基因，進一步大大提高qRT-PCR定量的準確性。

本發明的第二個目的是提供一種厚殼貽貝不同發育階段的熒光定量內參基因的引物。

本發明的第三個目的是提供一種厚殼貽貝不同發育階段的熒光定量內參基因和引物的應用。

為達到上述目的，本發明的解決方案是：

厚殼貽貝不同發育階段的熒光定量內參基因，熒光定量內參基因為RPS23、CYTB5、EF-1α和α-Tubulin，RPS23基因的堿基序列如SEQ ID NO.1所示，CYTB5基因的堿基序列如SEQ ID NO.2所示，EF-1α基因的堿基序列如SEQ ID NO.3所示，α-Tubulin基因的堿基序列如SEQ ID NO.4所示。

為達到上述第二個目的，本發明的解決方案是：