[發明專利]一種用于創面修復的干細胞羊膜敷料結構及其制備方法

在審

• 申請號: 202010576891.0
• 申請日: 2020-06-23
• 公開（公告）號: CN111790000A
• 公開（公告）日: 2020-10-20
• 發明（設計）人: 劉婧;楊學義;耿濤;劉苗苗;宋國英;王曉謙;張靜;宋丹
• 申請（專利權）人: 洛陽巴庫生物科技有限公司
• 主分類號: A61L15/40
• 分類號: A61L15/40;A61L15/42;A61L15/44
• 代理公司: 鄭州中科鼎佳專利代理事務所(特殊普通合伙) 41151
• 代理人: 蔡佳寧

1.一種用于創面修復的干細胞羊膜敷料結構，其特征在于：包括三部分結構，第一部分結構為一層醫用尼龍布，第二部分結構為與醫用尼龍布的外輪廓形狀大小相同的脫細胞羊膜，脫細胞羊膜縫合于尼龍布上，第一部分結構與第二部分結構共同構成脫細胞羊膜支架，第三部分結構為臍帶間充質干細胞，臍帶間充質干細胞覆于脫細胞羊膜上。

2.如權利要求1所述的一種用于創面修復的干細胞羊膜敷料結構，其特征在于：醫用尼龍布大小為4cm×4cm。

3.一種如權利要求1所述的用于創面修復的干細胞羊膜敷料結構的制備方法，其特征在于：步驟如下：步驟a.獲取臍帶間充質干細胞；步驟b.制備脫細胞羊膜支架；步驟c.將臍帶間充質干細胞加載于脫細胞羊膜支架上，構建、獲得干細胞羊膜敷料結構。

4.如權利要求3所述的一種用于創面修復的干細胞羊膜敷料結構的制備方法，其特征在于：步驟a中，首先收集產婦同意贈與且無病毒污染的臍帶組織，使用組織塊貼壁法培養臍帶間充質干細胞，然后制成單細胞懸液，按照(2-3)×10⁵個/ml細胞密度接種于培養瓶中，隨后，在37℃培養箱中，以無血清培養基進行培養，當細胞達到70%-80%融合度時進行傳代、擴增，當細胞傳至第3代后，收集所有的培養上清液，同時獲得第3代臍帶間充質干細胞。

5.如權利要求4所述的一種用于創面修復的干細胞羊膜敷料結構的制備方法，其特征在于：步驟b中，首先取健康產婦的胎盤羊膜組織，使用生理鹽水將羊膜組織表面清洗干凈，清洗后在含青霉素、鏈霉素、兩性霉素B的生理鹽水中浸泡10min；第二，將羊膜置于無菌方盤中，刮除海綿層，使用生理鹽水將羊膜表面浸泡、清洗干凈后，置于含有胰酶與EDTA的溶液中，使用搖床進行振蕩消化，隨后放入生理鹽水中，進行超聲振蕩洗滌；第三，將清洗過的羊膜剪成片狀，鋪于外輪廓形狀大小相同的尼龍布上，隨后使用縫紉機將羊膜與尼龍布進行縫合，制成脫細胞羊膜支架，在37℃下干燥，隨后置于甘油中密封，在-80℃下保存備用；第四，在進行步驟c之前，將-80℃保存的羊膜取出后，迅速放入37℃的恒溫箱內解凍，然后用含青霉素、鏈霉素、兩性霉素B的生理鹽水清洗除去甘油，隨后將脫細胞羊膜支架置于新換的含青霉素、鏈霉素、兩性霉素B的生理鹽水中，在恒溫37℃的條件下復水60min待用。

6.如權利要求5所述的一種用于創面修復的干細胞羊膜敷料結構的制備方法，其特征在于：羊膜組織來自于經檢測乙型肝炎病毒表面抗原、梅毒螺旋體抗體、HIV病毒抗體均為陰性的，足月生產的剖腹產婦的新鮮胎盤組織，將胎盤組織在無菌條件下鈍性剝離羊膜組織。

7.如權利要求6所述的一種用于創面修復的干細胞羊膜敷料結構的制備方法，其特征在于：所述的含有青霉素、鏈霉素、兩性霉素B的0.9%生理鹽水中，青霉素含量為：100U/mL、鏈霉素含量為：0.1mg/mL、兩性霉素B的含量為：0.25μg/mL。

8.如權利要求7所述的一種用于創面修復的干細胞羊膜敷料結構的制備方法，其特征在于：步驟b的第二步中，將刮除海綿層的羊膜在置于0.25%胰酶與0.02%EDTA的溶液中以后，需要在4℃的搖床內振蕩消化12小時；在搖床內振蕩消化后，放入生理鹽水內進行超聲振蕩洗滌，徹底除去殘留的上皮細胞；在步驟b的第三步中，將清洗過的羊膜剪成4cm×4cm大小。

9.如權利要求8所述的一種用于創面修復的干細胞羊膜敷料結構的制備方法，其特征在于：步驟c中，首先，在φ50cm的培養皿中加入1mL無血清培養基，將恒溫37℃，復水60min的脫細胞羊膜支架放入培養皿中，并緊貼板底，隨后放入恒溫箱中孵育30min，將收集到的第3代臍帶間充質干細胞加在脫細胞羊膜支架上；其次，將培養皿放入37℃、5%CO₂、飽和濕度條件下的培養箱中培養，第2天更換1次培養基，最終，細胞長滿整個羊膜界面，得到干細胞羊膜敷料結構，將其放入無菌儲存瓶，加入步驟a中收集到的培養上清液，存儲待用。

10.如權利要求9所述的一種用于創面修復的干細胞羊膜敷料結構的制備方法，其特征在于：在將第3代臍帶間充質干細胞加在脫細胞羊膜支架上時，細胞濃度為5×10⁵/mL，加1ml。