[發明專利]一株高效刺激免疫反應的沙門菌突變株及構建方法和應用

有效

• 申請號: 202010575533.8
• 申請日: 2020-06-22
• 公開（公告）號: CN111793591B
• 公開（公告）日: 2022-11-25
• 發明（設計）人: 劉瓊;黃孝天;李標先;曾令兵
• 申請（專利權）人: 南昌大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/74;C12N15/90;C12N15/31;A61K39/112;A61P31/04;C12R1/42
• 代理公司: 成都帝鵬知識產權代理事務所(普通合伙) 51265
• 代理人: 李華

1.一株高效刺激免疫反應的沙門菌突變株，其特征在于，所述突變株發生以下基因缺失突變?fliC、?fljB、?ompA、?ompC、?ompD，并敲除利于異源O抗原多糖表達的基因rfbP，同時轉入能夠完整表達志賀氏菌O抗原多糖的表達質粒。

2.根據權利要求1所述的高效刺激免疫反應的沙門菌突變株，其特征在于，所述突變株的命名為：Salmonella enterica serovar Typhimurium str. UK-1 ?fliC?fljB?ompA?ompC?ompD?rfbP，保藏號為CCTCC NO: M 2020142，保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏時間為2020年6月9日。

3.根據權利要求1所述的高效刺激免疫反應的沙門菌突變株，其特征在于，基因fliC的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，基因fljB的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，基因ompA的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，基因ompC的基因核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，基因ompD的基因核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，基因rfbP的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，志賀氏菌O抗原的基因序列如SEQ ID No.7所示。

4.一株高效刺激免疫反應的沙門菌突變株的構建方法，其特征在于，所述構建方法包括以下步驟：

（1）構建同源重組質粒pRE112-FliC、pRE112-FljB、pRE112-OmpA、pRE112-OmpC、pRE112-OmpD、pRE112-rfbP、表達志賀氏菌O抗原多糖的表達質粒；

（2）制備鼠傷寒沙門氏菌S100電轉化感受態細胞χ7232；

（3）將步驟（1）所得同源重組質粒通過電轉的方式轉化入鼠傷寒沙門氏菌S100電轉化感受態細胞χ7232中，將電轉杯移入電轉儀，2500伏電擊4毫秒；

（4）將電擊杯中的液體加入100 μL預熱的LB培養基，輕輕吹熄混勻后涂布于含有氯霉素抗性CmR的平板上，37℃培養過夜，產生的單克隆即為電轉成功的菌；

（5）通過PCR篩選得到不含FliC、FljB、OmpA、OmpC、OmpD 和rfbP基因，以及能夠表達志賀氏菌O抗原多糖的突變菌株。

5.根據權利要求4所述的構建方法，其特征在于，所述步驟（2）中電轉化感受態細胞χ7232的制備方法包括如下步驟：

1）挑取單菌落χ7232接種于LB液體培養基中，37℃振蕩培養過夜，取400 μL母液加入到100 ml 裝有LB培養基的三角瓶中，37℃、180 r/min振蕩培養至OD₆₀₀=0.8-1；

2）冰浴30 min，4℃，4500 r/min離心10 min收集菌體，沉淀用冰浴預冷的超純水洗兩遍，棄上清；

3）用預冷的10%甘油洗一遍，棄上清，菌體用60 μL預冷的10%甘油重懸，即制備好感受態備用。