[發明專利]一種prep基因缺失型斑馬魚的構建方法

有效

• 申請號: 202010574627.3
• 申請日: 2020-06-22
• 公開（公告）號: CN111575320B
• 公開（公告）日: 2022-11-29
• 發明（設計）人: 陸輝強;黃勇;廖信軍;賈坤;曹子崗;程波;鐘科元;馬進澤
• 申請（專利權）人: 贛南師范大學
• 主分類號: C12N15/90
• 分類號: C12N15/90;C12N15/85;A01K67/027
• 代理公司: 西安銘澤知識產權代理事務所(普通合伙) 61223
• 代理人: 崔瑞迎

1.prep基因在構建肝臟再生缺陷斑馬魚模型中的應用，其特征在于，所述肝臟再生缺陷斑馬魚模型的構建方法包括如下步驟：

S1、查詢斑馬魚prep基因的基因組DNA序列，并分析其功能結構域，根據CRISPR/Cas9敲除原理，在prep基因第3外顯子找到prep基因的靶位點，序列為5’-GGTCTCGCACTGCTCCAGGAAGG-3’，并設計靶位點長引物和gRNA接頭引物，靶位點長引物序列為5’-TaatacgactcactatagGGTCTCGCACTGCTCCAGGAAGG gttttagagctagaaatagc-3’；gRNA接頭引物序列為5’-AGCACCGACTCGGTGCCACTT-3’；

S2、primer star PCR獲得gRNA的體外轉錄模板：

S3、根據S2獲得的gRNA的體外轉錄模板進行體外轉錄，并提取純化，獲得純化的gRNA；

S4、將純化的gRNA和Cas9蛋白顯微注射至斑馬魚一細胞期的受精卵，培養獲得穩定遺傳prep純合突變斑馬魚品系，即肝臟再生缺陷斑馬魚模型。

2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于， S2中，反應體系總體積50ul，體系如下：

gRNA cDNA1ul，靶位點長引物1ul，gRNA接頭引物1ul，dNTP Mix 4ul，5×Primer starbuffer 10ul，Primer star酶1ul，ddH₂O 32ul。

3.根據權利要求2所述的應用，其特征在于， S2中，反應程序為：

98℃2min；重復35個循環以下步驟：98℃15s，58℃15s，72℃20s；72℃5min；72℃30min。

4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于， S3中，反應體系為：

模板DNA10ul，10×RNA polymerase Reaction buffer2ul，25mM rNTP Mix 0.8ul，RNase Inhibitor 0.5ul，T7 RNA polymerase 2ul，RNase free H₂O4.7 ul。

5.根據權利要求4所述的應用，其特征在于， S3中，反應程序為：

37℃，3小時。

6.根據權利要求5所述的應用，其特征在于，S4的培養具體包括以下步驟

S1、將顯微注射的受精卵培養孵化，Sanger測序檢測靶位點的有效性，篩選出有基因突變的，記作F0代，飼養至成魚；

S2、將F0代成魚與WT側交得到F1代；

S3、利用基因型鑒定的方法確定prep基因敲除的F1代突變體；

S4、從F1代突變體中挑選相同突變類型的F1代進行交配得到F2代；

S5、基因型鑒定F2代中prep基因敲除的純合子即為能穩定遺傳prep純合突變斑馬魚品系，即肝臟再生缺陷斑馬魚模型。