[發明專利]豬圓環病毒3型快速檢測熒光定量PCR試劑盒及其應用

有效

• 申請號: 202010571893.0
• 申請日: 2020-06-22
• 公開（公告）號: CN111621602B
• 公開（公告）日: 2023-03-14
• 發明（設計）人: 薛霜;徐松;萬佳;徐丹丹;李婷婷;謝紅玲;朱薇;漆世華;石寶蘭;李晶梅
• 申請（專利權）人: 國藥集團動物保健股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6851;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 武漢科皓知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 42222
• 代理人: 艾小倩

本發明公開了一種豬圓環病毒3型快速檢測熒光定量PCR試劑盒及其應用。試劑盒包括用于擴增豬圓環病毒3型cap基因保守區域的特異性引物對和特異性的TaqMan熒光標記探針；其中，上游引物序列為5’?TGGGCCTCCTAATGAATAGTTTT?3’，下游引物序列為5’?GAGACACAGAGCTATATTCAGAAG?3’；TaqMan熒光標記探針序列為5’FAM?CCAAGGAGACGACGACGC?BHQ13’。本發明試劑盒可同時進行大批量樣本的分析，靈敏度高、特異性好，用于快速定性/定量檢測豬圓環病毒3型的感染或感染早期的任一種或其組合，更優選用于定量檢測豬圓環病毒3型病毒拷貝數。

技術領域

本發明屬于病毒核酸檢測領域，具體涉及一種豬圓環病毒3型快速檢測熒光定量PCR試劑盒及其應用。

背景技術

豬圓環病毒病又叫仔豬多系統衰竭綜合癥(PMWS)，是由豬圓環病毒(Porcinecircoviruses，PCV)感染引起的以豬只體質下降、消瘦、腹瀉、呼吸困難、免疫抑制以及多病原繼發感染為主要特征的一類病毒性傳染病。豬圓環病毒是單股環狀的DNA病毒，基因組長度約為1.7kb長，是最小的動物DNA病毒之一。已經確定有兩種類型的PCV，即豬圓環病毒1型(PCV1)和豬圓環病毒2型(PCV2)。PCV1于1974年首次在細胞培養物中作為一種污染物鑒定，其對豬只沒有致病性。PCV2于1998年首次報道，能引起豬只的豬圓環病毒相關疾病(Porcine circovirus associated diseases，PCVAD)，主要引起仔豬多系統衰竭綜合征，肺炎、豬皮炎和腎病綜合征及繁殖障礙，該病對全世界的生豬養殖造成了重大的經濟損失。而近幾年，一種新型的豬圓環病毒，即豬圓環病毒3型(PCV3)首先在美國報道，該病毒基因組長為2.0kb，能引起豬的皮炎腎病綜合征、繁殖障礙以及心臟和多系統的炎癥反應。近期，華中農業大學何啟蓋教授組在我國首次檢出PCV3。研究人員通過大范圍的檢測發現，該病原可以在來自我國多個省份的樣品中檢測到，說明其在中國已廣泛存在。而在檢測到的PCV3陽性病料中，部分病料表現為PCV2和PCV3共感染。

病毒分離是實驗室確診特定病原體感染的經典方法，但由于PCV3在PK15細胞或ST細胞上均不產生細胞病變，目前仍未有研究資料報道能夠成功通過細胞分離到PCV3，而僅僅只是使用分子生物學檢測方法檢測到PCV3病毒核酸的存在，并進行測序鑒定。目前廣泛應用的常規PCR檢測方法簡單快速，但容易出現交叉污染，容易產生假陽性，而隱性感染和混合感染的豬群中病毒含量可能并不高。因此，建立一種快速、準確、靈敏且操作簡便的PCV3檢測方法勢在必行。

新興的實時熒光定量PCR技術不但克服了傳統PCR技術存在的缺點，且具有結果直觀可靠、特異性強、靈敏度高、快速簡單等優點，可以直觀地從分子生物學水平檢測到病毒核酸的存在。該技術包括染料法和探針法兩種，其中，染料法是利用能與雙鏈DNA結合的染料(如SYBR Green)結合到雙鏈DNA產物內部，再根據檢測到的熒光信號實現定量檢測的目的，但存在無法區分引物二聚體及非特異產物信號的缺陷；探針法是在常規的PCR基礎上加入一條特異性的熒光探針(如TaqMan探針)，根據探針兩邊標記的報告熒光基團和熒光淬滅基團之間產生的熒光共振能量轉移原理，釋放的熒光信號強度與擴增產物的量呈正比關系而實現定量檢測。但是，實驗室人員在使用實時熒光定量PCR技術時，通常需要分別購買熒光染料和酶體系，并花費大量時間用于設計合適的引物探針和優化反應體系等工作，且在目前的臨床檢測或科研實踐中，尚沒有開發出一種通過簡單操作即能實現快速檢測PCV3的試劑盒產品。

發明內容

針對現有技術的不足，本發明的目的在于提供一種豬圓環病毒3型快速檢測熒光定量PCR試劑盒及其應用，具體是指特異性檢測豬圓環病毒3型的熒光定量PCR試劑盒及其在豬圓環病毒3型快速檢測中的應用。

為實現上述目的，本發明的技術方案如下：