[發明專利]無創鑒定昆蟲基因型的方法

在審

• 申請號: 202010568531.6
• 申請日: 2020-06-19
• 公開（公告）號: CN111647664A
• 公開（公告）日: 2020-09-11
• 發明（設計）人: 魏麗亞;康樂;李靜;王彤欣;周夢;王笑笑
• 申請（專利權）人: 河北大學
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/6869
• 代理公司: 石家莊國域專利商標事務所有限公司 13112
• 代理人: 張莉靜

本發明提供了一種無創鑒定昆蟲基因型的方法。包括以下步驟：（a）將野生型昆蟲和基因編輯的昆蟲突變體分別進行飼養，每個昆蟲個體需要獨立標記或單獨飼養；（b）以昆蟲每蛻一次皮視為齡期增長一次，分別收集對應昆蟲1齡至成蟲期的蛻皮；（c）利用DNA提取試劑盒提取蛻皮的基因組DNA；（d）以蛻皮中提取的基因組DNA為模板，根據目的基因序列設計引物并進行PCR擴增，將擴增產物進行測序，進而鑒定基因型。本發明利用蛻皮可實現無創、早期、重復的昆蟲基因型鑒定，解決了剪取蟲體組織帶來的機械性損傷以及幼齡期蟲體無法鑒定的問題。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體地說是一種無創鑒定昆蟲基因型的方法。

背景技術

近年來，隨著對基因編輯技術CRISPR/Cas9系統研究的不斷深入，該系統以其操作簡易、省時、高效等優點被廣泛應用于眾多生物學研究領域，特別是對飛蝗(Locusta migratoria)、果蠅(Drosophilidae)、家蠶 (Bombyx mori)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)等多種昆蟲的研究中。在運用CRISPR/Cas9基因組定向編輯技術對昆蟲進行基因組編輯后，對所編輯個體的基因型鑒定就顯得尤為重要。

當前，鑒定昆蟲突變體所需的樣本組織主要以昆蟲全身或局部組織為材料提取基因組DNA。例如，在已公開的文獻中，埃及伊蚊(Aedes aegypti)、致乏庫蚊(Culex quinquefasciatus)、斜紋夜蛾(Spodoptera litura)、小菜蛾(Plutella xylostella)和棉鈴蟲(Helicoverpa armigera)的基因編輯實驗多采用從胚胎中提取其基因組DNA的方式；在柑橘鳳蝶(Papilio xuthus)、小紅蛺蝶(Vanessa cardui)和鹿眼蛺蝶(Junonia coenia)等鱗翅目昆蟲中，多以頭部、胸部、復眼和翅膀肌肉組織等局部組織為作為提取DNA的樣品，用以鑒定突變體的基因型。而在飛蝗中，也主要是以提取飛蝗前足前附節或血淋巴中的基因組DNA，從而完成基因型的鑒定。

這些傳統鑒定技術會對昆蟲個體帶來不可逆的機械損傷，甚至造成個體死亡，不利于突變體表型的觀察。此外，由于幼齡期的昆蟲較為脆弱，極易死亡，因此現有方法都不適用于昆蟲基因型的早期鑒定，僅對成年期昆蟲傷害較小，因此在利用CRISPR/Cas9進行基因編輯后，需要大量飼養突變個體至成蟲，時效性較差且易于造成時間和資源浪費。飛蝗為世界性農業害蟲，也是典型的漸變態類昆蟲。近期，一場大范圍的蝗災已席卷了全球20多個國家，對糧食安全造成了嚴重后果。近年來，以飛蝗基因組測序完成為契機，探索害蟲防治新型分子靶標成為研究熱點。結合CRISPR/Cas9技術在細胞水平對靶標基因功能進行初驗證，為后續在活體水平研究提供基礎數據，是完成對害蟲靶標基因的篩選和驗證的主要途徑。如何在無創的條件下完成對飛蝗個體基因型的鑒定是保證實驗表型初步篩選的關鍵。

發明內容

本發明的目的就是提供一種無創鑒定昆蟲基因型的方法，以解決現有鑒定方法會對蟲體帶來機械性損傷，幼齡期蟲體會因機械損傷死亡而無法進行早期鑒定以及基因型鑒定的準確性不理想的問題。

本發明的目的是這樣實現的：一種無創鑒定昆蟲基因型的方法，包括以下步驟：

（a）將野生型昆蟲和基因編輯的昆蟲突變體分別進行飼養，每個昆蟲個體需要獨立標記或單獨飼養；

（b）以昆蟲每蛻一次皮視為齡期增長一次，分別收集對應昆蟲1齡至成蟲期的蛻皮；