[發(fā)明專利]一種納米酶標記直接競爭仿生免疫分析檢測組胺的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010565907.8
• 申請日: 2020-06-19
• 公開（公告）號: CN111679068B
• 公開（公告）日: 2021-12-21
• 發(fā)明（設計）人: 徐志祥;王效鋒;王瑩;張利
• 申請（專利權）人: 山東農(nóng)業(yè)大學
• 主分類號: G01N33/545
• 分類號: G01N33/545;G01N33/58;G01N33/53
• 代理公司: 濟南譽豐專利代理事務所(普通合伙企業(yè)) 37240
• 代理人: 薛鵬喜

1.一種納米酶標記直接競爭仿生免疫分析檢測風干蝦中組胺的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)采用Pt@SiO₂納米材料標記抗原，以PAF-45為支持載體的分子印跡聚合物作為仿生抗體，將Pt@SiO₂納米材料標記抗原、仿生抗體和系列濃度梯度的組胺標樣溶液混合，室溫競爭反應30-50min，取上清液，加入TMB底物溶液進行顯色反應，用酶標儀在450nm波長下讀取紫外吸收值，計算抑制率；以組胺標樣溶液濃度對數(shù)值為橫坐標，抑制率為縱坐標，繪制標準曲線；

(2)利用步驟(1)繪制的工作曲線對經(jīng)前處理的待測物中的組胺含量進行檢測；

步驟(1)中，所述以PAF-45為支持載體的分子印跡聚合物由如下方法制備而成：

將模板分子組胺二鹽酸鹽溶于二甲基亞砜中，加入甲基丙烯酸，進行預聚合反應，預聚合反應的時間是30min；再加入PAF-45材料、二甲基丙烯酸乙二醇酯和偶氮二異丁腈，攪拌均勻，得到混合溶液；超聲脫氣，在氮氣環(huán)境下，水浴反應14～18h，反應結束后用甲醇-冰乙酸溶液索氏提取除去模板分子，得到分子印跡聚合物；

所述模板分子組胺二鹽酸鹽、甲基丙烯酸、二甲基丙烯酸乙二醇酯和PAF-45材料加入的質(zhì)量比為1：1.4：3.23：0.43～1.00；

所述PAF-45材料由如下方法合成：

將6g氯化鋁和100mL的CHCl₃在250mL圓底燒瓶中混合劇烈攪拌6h，然后80℃加熱30min；隨后將40mL含有800mg聯(lián)苯的CHCl₃溶液加入燒瓶中；持續(xù)加熱40min后，將溫度調(diào)至70℃，繼續(xù)加熱攪拌40min，冷卻后過濾得到紫黑色粗品；然后，用50％的乙醇和50％的鹽酸反復洗滌產(chǎn)物，去除剩余的聯(lián)苯和AlCl₃；最后用水沖洗至中性，將其置于60℃的真空環(huán)境中過夜；

步驟(1)中，所述Pt@SiO₂納米材料標記抗原由如下方法制備而成：

以PVP作為Pt@SiO₂納米酶合成的穩(wěn)定劑，將氯鉑酸溶液與聚乙烯吡咯烷酮混合在乙醇溶液中，在100℃條件下加熱回流3～4h，待冷卻后，將成品放入4℃避光保存；

在Pt NPs溶液加入氨水作為催化劑，滴加硅酸四乙酯，在室溫條件下反應2～4h，得到包覆二氧化硅的Pt@SiO₂；

對得到的Pt@SiO₂進行多次洗滌，除去過剩的硅酸四乙酯，然后在室溫條件下滴加3-氨基丙基三乙氧基硅烷，反應3～6h，反應結束后，多次洗滌，得到修飾后的Pt@SiO₂納米酶；

將氨基化的Pt@SiO₂材料和戊二醛混合0.5～1h；加入組胺溶液進行標記，反應結束后，離心分離，對反應物洗滌三次，得到Pt@SiO₂@HA；

步驟(2)中，所述前處理具體為：

向待測物中加入三氯乙酸溶液渦旋離心，重復提取2-4次，合并提取液，加入NaCl飽和后，用NaOH調(diào)節(jié)pH至12，用等比例的正丁醇-氯仿進行萃取，合并萃取液，40℃下氮氣吹干，用5mL乙醇溶解殘余物，0.22μm濾膜過濾；

所述待測物與三氯乙酸溶液加入量的比為5g：(10-20)mL。

2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)中，所述組胺標樣溶液由乙醇配成而成，其梯度濃度分別為：0.1mg/L、0.5mg/L、2.5mg/L、12.5mg/L、60mg/L和300mg/L。