[發(fā)明專利]一種雙水相酶解體系制備核苷酸的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010565179.0
• 申請(qǐng)日: 2020-06-19
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111621534B
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-04-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳曉春;張磊;湯亦文;李梓陽(yáng);蔡家棟
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京工業(yè)大學(xué);南京同凱兆業(yè)生物技術(shù)有限責(zé)任公司
• 主分類號(hào): C12P19/30
• 分類號(hào): C12P19/30;C12N9/22;C12R1/80
• 代理公司: 江蘇圣典律師事務(wù)所 32237
• 代理人: 胡建華

本發(fā)明公開(kāi)了一種雙水相酶解體系制備核苷酸的方法，在由聚乙二醇和硫酸銨組成的雙水相體系中，以核糖核酸為原料，通過(guò)核酸酶P1進(jìn)行酶解，所得反應(yīng)液即為由含有核苷酸的液體。本發(fā)明將核酸酶P1酶解核糖核酸制備核苷酸的過(guò)程與雙水相體系合理地集成，不僅提高了核酸酶P1的回收利用率，而且提高了核苷酸酶解率和成品收率，降低了生產(chǎn)成本，為核苷酸的生產(chǎn)及規(guī)模化制備提供了新思路和新工藝。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種雙水相酶解體系制備核苷酸的方法，具體涉及一種將核糖核酸酶解的過(guò)程與雙水相分離體系集成制備核苷酸的方法。

背景技術(shù)

5'-核苷酸已廣泛應(yīng)用于食品、生化工業(yè)以及制藥工業(yè)。在食品行業(yè)中，己經(jīng)由最初的食品助鮮劑擴(kuò)展為具有提高生物體免疫功能的功能性食品添加劑，可以添加在面包、餅干等食品中，尤其在嬰幼兒食品中的使用效果非常明顯，能夠有效增強(qiáng)嬰幼兒抵抗細(xì)菌性痢疾的能力，減少腹瀉的發(fā)生；在醫(yī)藥領(lǐng)域，5'-核苷酸不但能夠作為藥物使用，而且還是許多抗病毒、抗腫瘤藥物的生產(chǎn)原料；此外，核苷酸制劑還可以作為動(dòng)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，有著明顯的增產(chǎn)、增重功效。

核苷酸生產(chǎn)主要采取三種方法：化學(xué)合成法、微生物發(fā)酵法及酶解法。酶解法由于降解RNA可以一次得到四種核苷酸的混合物，且酶反應(yīng)收率較高，國(guó)內(nèi)外工業(yè)化生產(chǎn)核苷酸均采用此法。在酶解法制備核苷酸中所需的酶是核酸酶Pl，它是一種能夠水解RNA獲得四種5'-核苷酸的磷酸二酯酶，其酶解產(chǎn)物雜質(zhì)少后續(xù)分離工藝簡(jiǎn)單，國(guó)外一般采用該方法進(jìn)行核苷酸的生產(chǎn)。

雙水相萃取分離過(guò)程條件溫和、可調(diào)節(jié)因素多、易于放大和操作，并可借助傳統(tǒng)溶劑萃取的相關(guān)理論和經(jīng)驗(yàn)，不存在有機(jī)溶劑殘留問(wèn)題，特別適用于生物物質(zhì)的分離和提純。目前，雙水相萃取技術(shù)已被廣泛地應(yīng)用于生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和生物化工等領(lǐng)域。在生物催化過(guò)程中，雙水相體系可以將反應(yīng)物、產(chǎn)物以及酶分配于不同的水相中，最大限度地回收酶活力，同時(shí)提高催化反應(yīng)的效率，簡(jiǎn)化操作過(guò)程，能耗低，處理量大，降低投資和費(fèi)用，更重要的是易于過(guò)程放大，特別適合于工業(yè)化生物催化過(guò)程。

目前核苷酸的酶解反應(yīng)存在著核酸酶P1回收利用率低、工藝步驟較多以及生物加工過(guò)程不易放大等問(wèn)題。因此，提高核酸酶P1的回收利用率、提高酶解收率以及簡(jiǎn)化其規(guī)模放大過(guò)程就顯得尤為重要。

發(fā)明內(nèi)容

發(fā)明目的：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種雙水相酶解體系制備核苷酸的方法。

為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明公開(kāi)了一種雙水相酶解體系制備核苷酸的方法，在由聚乙二醇和硫酸銨組成的雙水相體系中，以核糖核酸為原料，通過(guò)核酸酶P1進(jìn)行酶解，所得反應(yīng)液即為由含有核苷酸的液體。

其中，所述的聚乙二醇的數(shù)均分子量為1000-6000，優(yōu)選為2000-5000，更優(yōu)選為為2000；所述的雙水相體系中，聚乙二醇的質(zhì)量百分比為1-50％，優(yōu)選為12％-48％，更優(yōu)選為24％。

其中，所述的雙水相體系中，硫酸銨的質(zhì)量百分比為1-50％，優(yōu)選為12％-24％，更優(yōu)選為18％。

其中，所述的雙水相體系中，核糖核酸的濃度為1-100g/L，優(yōu)選為30-80g/L，更優(yōu)選為50g/L。

其中，所述的核酸酶P1的用量為0.1-10L/kg核糖核酸，優(yōu)選0.6-1.5L/kg核糖核酸，更優(yōu)選為1L/kg核糖核酸；所述的核酸酶P1的酶活為1000-6000U/mL。