[發明專利]一種基于高分辨熔解曲線形狀鑒別15種動物源性成分的單管檢測試劑盒及檢測方法

有效

• 申請號: 202010563950.0
• 申請日: 2020-06-19
• 公開（公告）號: CN111690753B
• 公開（公告）日: 2023-07-18
• 發明（設計）人: 曹云剛;閔紅衛;徐秦峰;李敏康;蔡露陽
• 申請（專利權）人: 陜西科技大學
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 西安新思維專利商標事務所有限公司 61114
• 代理人: 李罡

1.一種鑒別15種動物源性成分的單管PCR高分辨率熔解曲線的檢測方法，其特征在于：

包括以下步驟：

1）參考黃牛、水牛、牦牛、山羊、綿羊、兔、馬、驢、豬、狗、貓、鼠、狐、貂、貉15種哺乳動物的基因序列，通過比對全基因組序列，設計篩選4對通用引物，所述的通用性引物具體序列為：

97bp對應的引物序列為：

上游引物：5'-?CAGACATCTGGTTCTTTCTTCAGGGC?-3'

下游引物：5'-GGGCTGATTAGTCATTAGTCCAT?-3'

140bp對應的引物序列為：

上游引物：5'-TCCCAGTACGAAAGGACAAGA-3'

下游引物：5'-CAATTACCGGGCTCTGCCA-3'

230bp對應的引物序列為：

上游引物：5'-ACAAGACGAGAAGACCC-3'

下游引物：5'-GATTGCGCTGTTATCCC-3'

512bp對應的引物序列為：

上游引物：5'-TGACCGTGCAAAGGTAGCAT-3'

下游引物：5'-ACCTGGATTACTCCGGTCTGA-3'；

2）選取步驟1）中97bp和140bp對應的引物對放入同一擴增體系中，以不同的哺乳動物基因組DNA為模板，進行PCR擴增實驗；

3）將步驟2）擴增產物進行高分辨熔解分析，采集不同動物種類的全部熔解曲線信息，經過統計學方法處理之后建立15種哺乳動物鑒別標準圖譜；

4）采用步驟2）和步驟3）的方法對未知樣品DNA模板進行單管PCR-HRM反應，利所建立的標準庫對樣品進行判別分析，驗證方法的準確性；

5）利用以上體系及方法對常見的混合肉物種進行檢測，得到檢測結果；

所述方法用于非疾病診斷目的。

2.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于：

步驟2）和步驟3）中提前采用主成分分析方法對97bp和140bp對應的引物分析出來熔解曲線數據進行理論分析。

3.根據權利要求2所述的檢測方法，其特征在于：

步驟2）中所述的同一擴增體系包括2×Taq?PCR?Master?Mix、飽和熒光染料、兩對通用性引物、不同動物的DNA模板以及雙蒸水；步驟2）中所優化的PCR反應條件為：94℃預變性5min，94℃變性15s，58℃退火20s，72℃延伸30s，再延伸5min。

4.根據權利要求3所述的檢測方法，其特征在于：

步驟3）中高分辨熔解分析條件如下：

擴增結束后，將擴增產物采用高分辨熔解在65℃-95℃之間進行分析，熔解速率為0.05℃/s，采集熒光數據，每個樣品重復4次測定。