[發明專利]基于熒光染料作為內標物的化學發光免疫分析法及其應用

在審

• 申請號: 202010563861.6
• 申請日: 2020-06-19
• 公開（公告）號: CN111650383A
• 公開（公告）日: 2020-09-11
• 發明（設計）人: 趙歡;何農躍;蘇恩本;林琦峰;孫家振;高陽;杜晗
• 申請（專利權）人: 東南大學;基蛋生物科技股份有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/58;G01N33/577;G01N33/543;G01N33/533;G01N21/64
• 代理公司: 北京弘權知識產權代理事務所(普通合伙) 11363
• 代理人: 逯長明;許偉群

1.一種基于熒光染料作為內標物的化學發光免疫分析法，其特征在于，包括：

將待測抗原的一株抗體直接或間接包被到熒光磁性微球的羧基上，形成抗體-熒光磁性微球；

將待測抗原的另一株抗體直接或者間接標記發光物，加入所述抗體-熒光磁性微球以及所述待測抗原，通過抗體-抗原-抗體的相互作用，形成發光物抗體-待測抗原-熒光磁性微球免疫復合物；

對所述復合物加磁場進行磁性分離，使所述復合物沉淀，并吸干廢液，除去未與所述復合物結合的物質，再用清洗液清洗沉淀的復合物；

利用熒光定量檢測儀讀取所述復合物的信號，得到熒光值；

利用儀器自動泵入激發液，使所述復合物產生化學發光信號，利用光電倍增器測量所述化學發光信號的發光強度；

根據所述熒光值對所述發光強度進行校準；

根據校準后的發光強度計算待測抗原的濃度。

2.如權利要求1所述的基于熒光染料作為內標物的化學發光免疫分析法，其特征在于，所述熒光磁性微球為表面含羧基，粒徑為500-3000納米，具有磁信號響應功能、表面基團功能化以及熒光特性的熒光磁性微球。

3.如權利要求2所述的基于熒光染料作為內標物的化學發光免疫分析法，其特征在于，所述熒光磁性微球通過以下方法制備：

在氮氣保護及預設攪拌速度下，將Fe²⁺、Fe³⁺按一定比例混合，采用共沉淀方法制備出納米Fe₃O₄顆粒；

洗滌去除多余的氯離子，干燥得到納米Fe₃O₄顆粒；

對所述納米Fe₃O₄顆粒進行油酸改性，制備Fe₃O₄磁流體；

基于細乳液復合液滴成核的乳液聚合制備方法，通過聚合反應在所述Fe₃O₄磁流體表面進行苯乙烯和丙烯酸的共聚，制備出表面含羧基的磁性高分子微球；

通過溶脹分散技術將熒光染料嵌入所述表面含羧基的磁性高分子微球內部，制得所述熒光磁性微球。

4.如權利要求3所述的基于熒光染料作為內標物的化學發光免疫分析法，其特征在于，所述發光物為N-(4-氨丁基)-N-乙基異魯米諾，吖啶酯，吖啶磺酰胺，辣根過氧化物酶，堿性磷酸酶中的任意一種可以和激發液或者底物作用產生化學發光的物質。

5.如權利要求4所述的基于熒光染料作為內標物的化學發光免疫分析法，其特征在于，所述熒光染料為FITC、Rhodamine、Alexa488、Cy3、Cy5、DiO、DiI、DiR中的任意一種具有吸收某一波長的光波后，能發射出另一波長大于吸收光的光波性質，且在與所述發光物的聯合使用中，所述熒光染料不與所述發光物干擾的物質。

6.如權利要求1所述的基于熒光染料作為內標物的化學發光免疫分析法，其特征在于，根據所述熒光值對所述發光強度進行校準的步驟中，根據：

對所述發光強度進行校準，其中，R為校準后計算得發光強度，F₀為熒光磁性微粒的初始熒光強度，F₁為熒光檢測儀測量熒光強度，R₁為光電倍增器測量發光強度。

7.如權利要求1～6中任一項所述的基于熒光染料作為內標物的化學發光免疫分析法在制備化學發光免疫檢測試劑盒中的應用。

8.一種化學發光免疫檢測試劑盒，其特征在于，基于權利要求1-6任一項所述的基于熒光染料作為內標物的化學發光免疫分析法制備，所述化學發光免疫檢測試劑盒還包含化學發光激發液系統。

9.如權利要求8所述的化學發光免疫檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒為檢測肌鈣蛋白I的磁化學發光免疫分析試劑盒。

10.如權利要求9所述的化學發光免疫檢測試劑盒，其特征在于，所述檢測肌鈣蛋白I的磁化學發光免疫分析試劑盒包含：

肌鈣蛋白I的一株單克隆抗體包被的共價偶聯了鏈親和素的磁性微粒、標記吖啶酯的肌鈣蛋白I的另一株單克隆抗體、第一激發液以及第二激發液，所述第一激發液為含有0.5wt％過氧化氫溶液的0.2M的硝酸溶液，所述第二激發液為含有1wt％Tween-20的0.5M氫氧化鈉溶液，所述肌鈣蛋白I的一株單克隆抗體和肌鈣蛋白I的另一株單克隆抗體為配對抗體。