[發明專利]一種容受甲基化半乳糖的瓊膠酶及其應用

在審

• 申請號: 202010563594.2
• 申請日: 2020-06-19
• 公開（公告）號: CN111647581A
• 公開（公告）日: 2020-09-11
• 發明（設計）人: 常耀光;曹斯琦;張玉瑩;薛長湖;申晶晶;王玉明;薛勇
• 申請（專利權）人: 中國海洋大學
• 主分類號: C12N9/38
• 分類號: C12N9/38;C12N9/24;C12N15/56;C12N15/70;C12N15/75;C12N15/81;C12N1/21;C12N1/19;C12P19/14;C12P19/12;C12P19/04;C12P19/00;C12R1/19;C12R1/125
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本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種容受甲基化半乳糖的瓊膠酶及其應用。所述瓊膠酶的氨基酸序列為SEQ ID NO.1以及經過取代、缺失或添加一個或多個氨基酸且具有相同酶活性的，由此所衍生的酶。本發明的瓊膠酶能夠容受甲基化半乳糖，對于甲基化的瓊脂糖結構片段以及經典的瓊脂糖結構片段均具有高效的催化能力；相比于普通的瓊膠酶能更完全的降解瓊膠，提高其生物利用率。通過控制加酶量或反應時間等條件，可快速降解瓊脂糖生成分子量為6kDa?900kDa的不同分子量瓊脂糖及寡糖。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種容受甲基化半乳糖的瓊膠酶及其應用。

背景技術

瓊膠是從海洋紅藻細胞壁中提取的多糖，是一種重要的海洋多糖。瓊脂糖是瓊膠的主要組分，具有優良的凝膠特性，廣泛地應用于食品及食品相關工業、化妝品、藥品等行業。瓊脂糖由(1-3)-O-β-d-吡喃半乳糖殘基(G殘基)及(1-4)-O-3,6-內醚-α-l-吡喃半乳糖殘基(LA殘基)交替組成。多項研究表明，瓊脂糖的結構具有高度異質性，其結構中的G殘基往往被甲基化修飾，且修飾程度高達20％。

瓊脂糖在室溫下不易溶解，生物利用率低。由瓊脂糖降解得到的低分子瓊脂糖以及寡糖具有水溶性好、粘度低、生物利用率高的特點，并且具有抗菌、保濕皮膚、黑色素瘤細胞增白、抗肥胖、抗糖尿病等多種生物活性，是潛在的功能食品因子，在食品、醫藥行業中展現出良好的應用前景。

糖苷水解酶能特異性的切割瓊脂糖主鏈中的糖苷鍵并且不改變其天然結構中的取代基。與常用的酸解相比，采用酶降解瓊脂糖不僅反應條件溫和，綠色環保，能耗低，并且具有酶的高效性與底物專一性的特點，可有效的克服酸解存在的條件難控制、產物不均一、產物分析和回收難等問題。瓊膠酶是一類可特異性降解瓊膠中的瓊脂糖組分，生成瓊脂寡糖的水解酶，根據酶切位點不同，瓊膠酶可被分為α-瓊膠酶和β-瓊膠酶，分別切割α-1,3糖苷鍵和β-1,4糖苷鍵。

糖苷水解酶的高度特異性以及多糖結構的異質性，意味著多糖的完全轉化需要特異性不同的水解酶。目前已被表征的傳統的瓊膠酶特異性強，只能降解經典的瓊膠結構片段，即(LA-G)_n，而無法降解含有甲基的多糖片段。因此，這些瓊膠酶無法完全降解含甲基的天然瓊脂糖。尋找能夠容受甲基化半乳糖的瓊膠酶對于提高瓊脂糖的生物利用率與轉化率至關重要。在目前的研究報道中，僅有一個來自Pseudomonas atlantica的野生型瓊膠酶能水解甲基化的瓊脂糖，但野生酶需要在瓊脂糖的誘導下才可產生，且其制備成本高、純化難度大，且產酶總量低、活力低，難以用于工業的大規模生產應用中。分子克隆可以依據基因實現酶的高效表達及大量獲取，是解決以上問題的理想策略。實現產酶序列的克隆表達可為酶法降解瓊脂糖提供工具，為低分子量瓊脂糖及寡糖的大規模生產應用提供前提。

發明內容

本發明要解決的技術問題為野生型容受甲基化半乳糖的瓊膠酶產量低、活力低、純化難度大，產酶菌株需在瓊脂糖底物的誘導下才可產酶，致使酶的制備成本高、缺少完全轉化瓊脂糖的關鍵工具酶。

為解決上述問題，本發明從Wenyingzhuangiafucanilytica CZ1127^T菌株中發掘得到一條基因，其原始核苷酸編碼735個氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，利用ExPASy軟件預測其理論分子量為79.73kDa。根據序列比對發現此酶與目前報道的同家族的瓊膠酶的相似性最高僅為47％，所以此酶為一種序列新穎的酶。以此為基礎提供一種容受甲基化半乳糖的瓊膠酶的基因及其應用，從而突破該類酶的高效獲取及實際應用、瓊脂糖的完全轉化、低分子量瓊脂糖及寡糖規?；苽涞年P鍵瓶頸。

為達到上述目的，本發明提供一種容受甲基化半乳糖的瓊膠酶，其氨基酸序列為SEQ ID NO.1以及經過取代、缺失或添加一個或多個氨基酸且具有1中酶活性的，由1所衍生的酶。

SEQ ID NO.1：