[發明專利]一種提高司美魯肽前體產量及菌體密度的方法

在審

• 申請號: 202010560134.4
• 申請日: 2020-06-18
• 公開（公告）號: CN111763704A
• 公開（公告）日: 2020-10-13
• 發明（設計）人: 孫劍峰;孔凡樓;張穎;張立志;楊雨;閆飛
• 申請（專利權）人: 濟南康和醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12P21/02
• 分類號: C12P21/02;C12N1/21;C12N1/38;C12R1/19
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種用于大腸桿菌發酵產生司美魯肽前體的基礎培養基，其特征在于，由以下成分及配比組成：磷酸二氫鉀0.5～10g/L，酵母浸粉1～15g/L，一水檸檬酸0.5～4g/L，檸檬酸鐵銨0.05～0.3g/L，葡萄糖1～20g/L，七水硫酸鎂0.5～5g/L，微量元素液10～30ml/L，全氟化碳乳液1～10ml/L，pH值6.80～7.20。

2.根據權利要求1所述的基礎培養基，其特征在于，由以下成分及配比組成：磷酸二氫鉀3.5g/L，酵母浸粉6g/L，一水檸檬酸1.4g/L，檸檬酸鐵銨0.13g/L，葡萄糖8g/L，七水硫酸鎂2.12g/L，微量元素液16.7ml/L，全氟化碳乳液8ml/L，pH值7.00。

3.根據權利要求1或2任意一項所述的基礎培養基，其特征在于，全氟化碳乳液的制備方法為：

a)基礎乳液的制備：將乳化組分及Tyrode溶液經過低溫超聲乳化得到基礎乳液；

b)全氟化碳乳液的制備：將全氟化碳組分加入到基礎乳液中，進一步經低溫超聲和高壓均質機處理得到全氟化碳乳液。

4.根據權利要求1或2任意一項所述的基礎培養基，其特征在于，微量元素液由以下成分及配比組成：七水硫酸鋅2.9g/L，四水合七鉬酸銨3.7g/L，硼酸24.7g/L，五水硫酸銅2.5g/L，四水合氯化錳15.8g/L。

5.根據權利要求3所述的基礎培養基，其特征在于，乳化組分為蛋黃卵磷脂、溶血磷脂酰膽堿、膽固醇、鞘磷脂等中的一種；全氟化碳組分為全氟三丁胺、全氟十三胺、全氟溴辛烷、全氟正丁基呋喃、全氟萘烷、全氟甲基萘烷、全氟三丙胺中的一種或混合物。

6.一種用于大腸桿菌發酵產生司美魯肽前體的含全氟碳化乳液的補料培養基，其特征在于，配方為：蛋白胨30～60g/L，酵母浸粉50～200g/L，葡萄糖400～500g/L，七水硫酸鎂0.1～1g/L，全氟化碳乳液5～20ml/L。

7.根據權利要求6所述的補料培養基，其特征在于，配方為：蛋白胨45g/L，酵母浸粉150g/L，葡萄糖500g/L，七水硫酸鎂0.5g/L，全氟化碳乳液15ml/L。

8.一種利用大腸桿菌發酵產司美魯肽前體的方法，其特征在于，使用上述所述基礎培養基和補料培養基，具體包含如下步驟：

(1)種子液制備：將超低溫冰箱保存的大腸桿菌甘油菌種接種于含100ml LB培養基的500ml搖瓶，37℃、220rpm搖床培養5～7h作為種子液；

(2)分批培養：0.5～2L種子液接入含20L發酵基礎培養基的50L發酵罐中，起始培養條件為37℃，pH 7.0，轉速300rpm，通氣量0.5m³/h，隨著培養的進行，先增大通氣量直至5.0m³/h，再增大轉速直至780rpm，控制溶氧30％及以上，培養6～7h；

(3)分批補料培養：分批培養結束后，以400～900ml/h的速率流加補料培養基1～3h；

(4)誘導培養：分批補料結束后，控制溫度為22～28℃，pH為6.00～7.50，加入終濃度為0.1～1.0mM的IPTG開始誘導，誘導過程中控制溶氧20～50％；

(5)取樣檢測及發酵結束：誘導培養開始后，每3小時取發酵液樣品一次，3000～12000rpm離心5～10min，測定上清液中司美魯肽前體表達量，待表達量增加緩慢或減少時，結束發酵。

9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于，步驟(1)中LB培養基的配方為：蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，氯化鈉10g/L，pH值為7.00；步驟(2)中種子液為1L；步驟(3)中補料方式為恒速補料，速度為700ml/h；步驟(4)中，誘導溫度為23℃，pH為7.20，IPTG濃度為0.3mM，溶氧控制在30％～40％。