[發明專利]可變換CAS9核酸酶及其用途

在審

• 申請號: 202010559856.8
• 申請日: 2014-09-05
• 公開（公告）號: CN111893103A
• 公開（公告）日: 2020-11-06
• 發明（設計）人: D.R.劉;J.H.胡
• 申請（專利權）人: 哈佛大學的校長及成員們
• 主分類號: C12N9/22
• 分類號: C12N9/22;C12N15/113
• 代理公司: 北京市柳沈律師事務所 11105
• 代理人: 張文輝

本公開內容的一些方面提供了用于控制RNA可編程內切核酸酶(諸如Cas9)的活性和/或改善RNA可編程內切核酸酶(諸如Cas9)的特異性的組合物、方法、系統和試劑盒。例如，提供了工程化改造為以“開啟”或“關閉”狀態存在的引導RNA(gRNA)，其控制RNA可編程內切核酸酶的結合以及因此切割活性。本公開內容的一些方面提供了mRNA感測性gRNA，其基于靶mRNA的存在或缺乏調控RNA?可編程內切核酸酶的活性。本公開內容的一些方面提供了gRNA，其基于延長的DNA(xDNA)的存在或缺乏調控RNA?可編程內切核酸酶的活性。

本申請是申請日：2014年9月5日、申請號：201480058811.5、發明名稱為“可變換CAS9核酸酶及其用途”的中國發明專利申請的分案申請。

相關申請

本申請要求2014年7月8日提交的美國申請U.S.S.N.14/326,329，2014年7月8日提交的美國申請U.S.S.N.14/326,340，和2014年7月8日提交的美國申請U.S.S.N.14/326,361的在35 U.S.C.§365(c)下的優先權，而且還要求2013年9月6日提交的美國臨時申請U.S.S.N.61/874,682的在35 U.S.C.§119(e)下的優先權，每篇通過提及并入本文。

背景技術

位點特異性內切核酸酶在理論上容許靶向操作基因組內的單一位點，并且在基因靶向的背景中以及對于治療應用是有用的。在多種生物體(包括哺乳動物)中，位點特異性內切核酸酶已經用于通過刺激非同源末端連接或同源重組來進行基因組工程。在提供有力的研究工具外，位點特異性核酸酶還具有作為基因治療劑的潛力，并且兩種位點特異性內切核酸酶最近已經進入臨床試驗：一種(即CCR5-2246)靶向人CCR-5等位基因作為抗HIV治療辦法的一部分(NCT00842634,NCT01044654,NCT01252641)，和另一種(VF24684)靶向人VEGF-A啟動子作為抗癌治療辦法的一部分(NCT01082926)。

在沒有脫靶活性或僅具有最小脫靶活性的情況中對意圖核酸酶靶位點的特異性切割是位點特異性內切核酸酶的臨床應用，和還是基礎研究應用中的高效率基因組操作的前提。例如，工程化位點特異性結合域的不完全特異性已經與除了意圖靶物外的基因組基因座的不想要變化和細胞毒性聯系起來。然而，目前可用的大多數核酸酶展現出相當大的脫靶活性，并且如此可能不適合于臨床應用。一種在臨床和研究背景中使用的出現的核酸酶平臺是RNA引導性核酸酶，諸如Cas9。雖然這些核酸酶能夠結合引導指導特異性靶位點切割的RNA(gRNA)，但是仍對某些Cas9:gRNA復合物觀察到脫靶活性(Pattanayak et al.,“High-throughput profiling of off-target DNA cleavage reveals RNA-programmedCas9 nuclease specificity.”Nat Biotechnol.2013；doi:10.1038/nbt.2673)。因此，需要將核酸酶工程化改造為具有改善的特異性的技術。

發明內容

本公開內容的一些方面基于下述認識，即一些工程化位點特異性內切核酸酶的報告的毒性基于脫靶DNA切割。此外，一般不能在分子水平上控制存在的RNA引導性核酸酶的活性，例如，以將核酸酶從“關閉”轉換成“開啟”狀態。控制核酸酶的活性可以降低招致脫靶效應的可能性。本公開內容的一些方面提供了控制RNA-可編程內切核酸酶(諸如Cas9內切核酸酶)的結合和/或切割活性的策略、組合物、系統和方法。

因而，本公開內容的一個實施方案提供了RNA引導性核酸酶復合物，其包含“可變換”引導RNA(gRNA)。例如，在一些實施方案中，本發明提供了復合物，其包含：(i)包含適體的gRNA，其中gRNA在缺乏與適體結合的特定配體的情況中不與靶核酸雜交；和(ii)Cas9蛋白。在一些實施方案中，適體由配體結合。在一些方面中，配體是任何分子。在一些方面中，配體是小分子、代謝物、碳水化合物、肽、蛋白質或核酸。在一些實施方案中，gRNA:配體:Cas9復合物結合靶核酸并且介導靶核酸的切割。參見例如圖1A-D。