[發(fā)明專利]用于檢測(cè)裸蓋魚的RPA引物、探針及檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010559761.6
• 申請(qǐng)日: 2020-06-18
• 公開（公告）號(hào): CN111793696B
• 公開（公告）日: 2023-01-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 林霖;朱成杰;余灝;王坤;吳佳輝;馮榮虎;張世偉;陳國(guó)培;賴心田;楊國(guó)武
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 深圳市計(jì)量質(zhì)量檢測(cè)研究院(國(guó)家高新技術(shù)計(jì)量站;國(guó)家數(shù)字電子產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心)
• 主分類號(hào): C12Q1/6888
• 分類號(hào): C12Q1/6888;C12Q1/6844;C12N15/11
• 代理公司: 深圳市科吉華烽知識(shí)產(chǎn)權(quán)事務(wù)所(普通合伙) 44248
• 代理人: 胡吉科

本發(fā)明提供一種檢測(cè)裸蓋魚的RPA引物、探針和檢測(cè)方法，是基于裸蓋魚的NADH₂基因設(shè)計(jì)的，RPA探針的長(zhǎng)度為46?54bp，且在探針中間距5’端32bp的位置處采用dSpacer修飾，dSpacer分子兩側(cè)的距5’端31bp和34bp位置的胸腺嘧啶（dT）分別被熒光基團(tuán)FAM和淬滅基團(tuán)BHQ1取代，并且在探針的3’末端也需要通過(guò)阻塞基團(tuán)C3Spacer修飾，RPA技術(shù)具有操作簡(jiǎn)便、反應(yīng)快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)、無(wú)需精密儀器等優(yōu)點(diǎn)，本發(fā)明基于RPA技術(shù)設(shè)計(jì)裸蓋魚特異性引物探針，建立的檢測(cè)方法操作方便，可實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。本發(fā)明的檢測(cè)方法在15?20分鐘內(nèi)完成檢測(cè)，可快速樣品是否為裸蓋魚。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及檢測(cè)領(lǐng)域，尤其涉及一種檢測(cè)裸蓋魚的RPA引物、探針和檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

裸蓋魚（Anoplopoma fimbria），也俗稱黑鱈，屬于輻鰭魚綱、鲉形目、黑鲉科。該魚捕撈量每年全美只有一萬(wàn)噸，價(jià)格昂貴，約200-300元一斤。其擁有豐富的ω-3脂肪酸，且容易進(jìn)行人工養(yǎng)殖，因此是重要的經(jīng)濟(jì)魚類。有研究表明ω-3脂肪酸對(duì)人體大有裨益，對(duì)于平常人，不僅能夠改善心血管健康，預(yù)防致命性心律失常、緩解炎癥，對(duì)于胎兒的大腦發(fā)育和視網(wǎng)膜正常發(fā)育也至關(guān)重要，還在一定程度上影響了兒童認(rèn)知、語(yǔ)言或運(yùn)動(dòng)能力。

裸蓋魚屬于深海大型魚類，售賣時(shí)一般去除頭尾，以魚塊、魚扒等方式分割小包裝售賣，因此無(wú)法通過(guò)形態(tài)學(xué)上區(qū)分摻偽魚類。在中國(guó)香港食物安全中心發(fā)布的《有關(guān)識(shí)別及標(biāo)簽油魚/鱈魚的指引》中允許使用“銀鱈魚”對(duì)裸蓋魚進(jìn)行標(biāo)注。據(jù)市場(chǎng)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)市場(chǎng)上銷售的裸蓋魚，有85.7 %被鑒定為南極犬牙魚。南極犬牙魚，屬輻鰭魚綱、鱸形目、南極魚科、犬牙南極魚屬，含小鱗南極犬牙魚（Dissostichus eleginoides）和鱗頭南極犬牙魚（Dissostichus mawsoni）兩個(gè)經(jīng)濟(jì)種）。南極犬牙魚主要存在過(guò)度捕撈問(wèn)題，如今出于對(duì)該魚的保護(hù)，只有少數(shù)國(guó)家和地區(qū)可以有限的捕撈，但非法捕撈仍然存在，鑒于我國(guó)的魚類溯源系統(tǒng)并沒有其他歐美國(guó)家健全，據(jù)報(bào)道非法捕撈的南極犬牙魚將在中國(guó)進(jìn)行銷售，因此導(dǎo)致了我國(guó)大部分銷售的裸蓋魚實(shí)為南極犬牙魚的現(xiàn)狀。在中國(guó)香港發(fā)布的指引中允許使用“白鱈魚”對(duì)南極犬牙魚進(jìn)行標(biāo)注。

發(fā)明內(nèi)容

我國(guó)市場(chǎng)監(jiān)督管理總局于2019年發(fā)布了食品補(bǔ)充檢驗(yàn)方法《鱈魚及其制品中裸蓋魚、油魚和南極犬牙魚源性成分檢測(cè)》（BJS 201907），使用方法為實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法。另外還有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法GB/T 35918-2018《動(dòng)物制品中動(dòng)物源性檢測(cè)基因條碼技術(shù) Sanger測(cè)序法》中規(guī)定了魚類基于基因條形碼測(cè)序的通用鑒別方法，可對(duì)裸蓋魚進(jìn)行檢測(cè)。但是，這些方法需要依賴昂貴的精密設(shè)備如測(cè)序儀、熒光PCR儀等，對(duì)人員操作、環(huán)境條件等要求高，對(duì)設(shè)備的校正維護(hù)等也有較高的成本，因此不符合在移動(dòng)實(shí)驗(yàn)室、現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)、廠家進(jìn)貨驗(yàn)收、企業(yè)自檢等情景的操作需求。另外， Sanger測(cè)序法因受檢測(cè)原理限制（需要每個(gè)堿基單峰，以識(shí)別堿基ATGC），不能對(duì)多來(lái)源樣品檢測(cè)，因此無(wú)法應(yīng)用于對(duì)摻偽、混合樣品檢測(cè)中。

為此，本發(fā)明提供一種用于檢測(cè)裸蓋魚的RPA引物、探針和檢測(cè)方法。

重組酶聚合酶擴(kuò)增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA）技術(shù)做為一種新型的核酸擴(kuò)增技術(shù)，其被譽(yù)為最有可能取代PCR的技術(shù)。該技術(shù)具有操作簡(jiǎn)便、反應(yīng)快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)、無(wú)需精密儀器等優(yōu)點(diǎn)，使其在臨床診斷和疾病防控等現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)方面顯示出了巨大的潛力。相比其他技術(shù)，RPA技術(shù)有更多的靈活性，不僅可以檢測(cè)DNA也可以檢測(cè)RNA，且通過(guò)不同的修飾可實(shí)現(xiàn)以不同的方式展示實(shí)驗(yàn)結(jié)果。如與便攜式擴(kuò)增儀結(jié)合可實(shí)時(shí)在線監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，與凝膠電泳結(jié)合可實(shí)現(xiàn)產(chǎn)物的回收，與試紙條的結(jié)合可以實(shí)現(xiàn)無(wú)需儀器設(shè)備快速的讀取實(shí)驗(yàn)結(jié)果。