[發明專利]一種用于檢測小鼠肝炎病毒的超快速實時熒光VPCR試劑盒和方法

在審

• 申請號: 202010559397.3
• 申請日: 2020-06-18
• 公開（公告）號: CN111690774A
• 公開（公告）日: 2020-09-22
• 發明（設計）人: 唐卓;張磊;杜鳳;周靜;董娟;袁明銘;董涵
• 申請（專利權）人: 中國科學院成都生物研究所;四川省中醫藥科學院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11
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• 代理人: 暫無信息

本發明涉及包含SEQ ID NO.1～2所示引物對和SEQ ID NO.3所示探針的用于小鼠肝炎病毒檢測的超快速實時熒光VPCR試劑盒，還涉及用于檢測肺小鼠肝炎病毒的方法。本發明試劑盒及方法可以準確檢測樣品中的小鼠肝炎病毒，基因擴增在40分鐘內完成，快速簡便，成本低廉，特異性和靈敏度高，應用前景良好。

技術領域

本發明屬于分子生物學領域，具體涉及一種用于檢測小鼠肝炎病毒的超快速實時熒光VPCR試劑盒和方法。

背景技術

小鼠肝炎病毒(Mouse hepatitis virus，MHV)屬冠狀病毒科、冠狀病毒屬，為單股正鏈RNA病毒。自然宿主為小鼠，也容易感染裸鼠與免疫缺陷小鼠。小鼠肝炎病毒一般呈隱形或亞臨床感染，但具有高度傳染性，傳染途徑依不同型分為飛沫傳染或經口傳染。小鼠肝炎病毒可能引起小鼠肝炎、腦炎和腸炎，感染后的小鼠免疫功能有可能下降，從而會引起鼠群急性感染，導致動物死亡。

隨著我國生物科學、醫學、藥學等方面科研水平的不斷提高，實驗動物行業變成了不可或缺的組成部分之一，影響著整個科學研究的質量。實驗動物微生物學標準GB/T14926.22-2001規定：MHV是實驗動物清潔級及以上級別小鼠必須檢測的項目之一，及時檢出MHV具有重要意義。目前，用于檢測MHV的方法主要為酶聯免疫吸附方法(Enzyme-linkedimmunosorbent assay,ELISA)、免疫熒光方法(Immuno-fluorescence assay,IFA)和免疫酶法(Immuno-enzymatic Assay，IEA)。雖然免疫檢測方法具有簡便快捷、對實驗室設備和人員要求較低的優勢，但進行抗體檢測時，從病毒進入小鼠機體到小鼠產生特異性的抗體需要幾天的窗口期，該技術難以在小鼠感染初期檢出陽性結果；而且還容易受到小鼠體內的干擾物質影響，導致假陰性結果出現，從而造成病毒在小鼠間傳播開來。核酸作為病原體感染后最先能被檢測到的標志物，其檢測對于及時、有效地檢出MHV、保證動物實驗結果的準確性具有非常重要的意義。目前MHV核酸檢測方法包括普通PCR、實時熒光PCR和恒溫擴增等。普通PCR需要開蓋進行凝膠電泳，操作繁瑣，容易污染，并且檢測通量非常低。恒溫擴增技術是繼PCR技術后發展起來的一種新型的體外核酸擴增技術，具有恒溫、高效、不需要特殊儀器設備等優點，但由于其對引物設計要求特別高、需要的酶種類多且結果不太穩定等原因，目前尚未廣泛應用于實驗動物核酸檢測。專利CN101914631B中發明了一種檢測小鼠肝炎病毒的實時熒光定量PCR的方法，擴增檢測同時完成，自動化程度高，具有靈敏度高、特異性強、重復性好等優點，實時熒光PCR是目前核酸檢測應用最廣的方法。但是存在檢測時間長的問題，通常需要1-2小時，導致MHV檢測效率低，不適合用于大量樣本篩查。因此對于小鼠肝炎病毒的檢測，目前迫切需要發明快速準確的檢測方法。

本單位(中國科學院成都生物研究所)在2018年申請了最新的核酸擴增專利技術--VPCR技術(專利號：201810647599.6)，該方法改變了傳統PCR需要在兩個或三個溫度點上的固定時間來進行變性、退火及延伸的DNA擴增方式，而變為在高低的兩個溫度點之間不間斷地進行往復升降溫，讓DNA雙鏈的打開、引物對模板的結合與延伸在一個持續變溫過程中完成，前期的方法學研究(Theranostics,2019,9,1572-1579.)表明VPCR這種動態的加熱方式不但不會犧牲每次循環的擴增效率，同時在保證與傳統PCR相當的靈敏度與準確性的前提下，能夠利用現有的核酸擴增裝置和擴增體系將PCR的反應時間縮短三分之二。將VPCR技術和實時熒光PCR技術進行結合，應用到MHV檢測中，能將檢測時間從2個小時縮短至40分鐘，從而大幅度提高了檢測的效率，適用于大量樣本的快速篩查。

發明內容

本發明的目的在于提供一種用于檢測小鼠肝炎病毒的超快速實時熒光VPCR試劑盒和方法。

本發明提供了SEQ ID NO.1～2所示的引物對、SEQ ID NO.3所示的探針。