[發明專利]一種去內毒素質粒提取試劑盒及質粒提取的方法

在審

• 申請號: 202010559313.6
• 申請日: 2020-06-18
• 公開（公告）號: CN111676215A
• 公開（公告）日: 2020-09-18
• 發明（設計）人: 關紅衛;李婧;魏洪運
• 申請（專利權）人: 沈陽德宇生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 沈陽中宇天信專利代理有限公司 21248
• 代理人: 陳慧

一種去內毒素質粒提取試劑盒及質粒提取的方法，該去內毒素質粒提取試劑盒至少包括菌體裂解試劑、雜質去除試劑、質?；厥赵噭┖蛢榷舅厝コ噭?；按體積比，各個試劑的體積比例為：菌體裂解試劑的試劑一：菌體裂解試劑的試劑二：雜質去除試劑：質粒回收試劑：內毒素去除試劑的試劑A：內毒素去除試劑的試劑B＝(10～30):(10～30):20:20:30:7。還涉及一種質粒提取方法。該去內毒素質粒提取試劑盒在去內毒素的操作簡單，操作時間短，質粒提取效率高，內毒素去除效率可達到99％以上，并且去內毒素質粒提取試劑盒的提取菌量無限制，可滿足所有無內毒素實驗要求，是生物研究實驗，及相關藥學試驗比較有優勢。

技術領域

本發明涉及分子生物學領域，具體地涉及一種去內毒素質粒提取試劑盒及質粒提取的方法，該方法可以對質粒進行大量提取。

背景技術

在許多分子生物學研究中，質粒提取和純化是實驗中重要的環節。一種可以獲得大量高純度，無內毒素的質粒的提取方法對分子生物學具有重要意義。

在許多研究中，尤其是基因治療和DNA疫苗在癌癥﹑單基因遺傳病﹑心血管疾病等疾病的診斷和治療方面，質粒提取顯示出了突出的優勢。目前質粒正逐漸成為基因治療的重要基因傳遞工具，把一個目的DNA片段通過基因重組技術，送入受體細胞體內進行繁殖和表達，細菌質粒是重組技術中最常用的載體之一。質粒還具有一些特定的遺傳信息，會給宿主細胞一些遺傳性狀比如標記基因，這些特點對基因工程研究及其下游的應用都是非常實用和具有價值的。

但在許多分子生物學及藥學相關研究中，所用的質粒是不能含有內毒素成分的，這是因為內毒素會對原代細胞和敏感培養細胞的DNA轉染過程造成重要影響，內毒素水平的升高會導致轉染效率的急劇下降，因此，需要對提取的質粒進行內毒素去除操作。但目前所售去內毒素試劑盒中，存在去內毒素操作時間長，內毒素去除效果差等缺點，并且根據提取菌量的體積，設計成無內毒素質粒小提、中提、大提試劑盒，設計種類繁雜。因此，需要一種新的去內毒素質粒提取試劑盒，以及質粒提取方法。

發明內容

本發明針對目前市售去內毒素質粒提取試劑盒操作時間長，內毒素去除效果不理想，試劑盒種類繁雜等問題，提供了一種去內毒素質粒提取試劑盒及質粒提取的方法。該去內毒素質粒提取試劑盒是基于堿裂解法開發的，該去內毒素質粒提取試劑盒在去內毒素的操作簡單，操作時間短，質粒提取效率高，內毒素去除效率可達到99％以上，并且去內毒素質粒提取試劑盒的提取菌量無限制，可滿足所有無內毒素實驗要求，是生物研究實驗，及相關藥學試驗比較有優勢。

本發明的一種去內毒素質粒提取試劑盒，至少包括菌體裂解試劑、雜質去除試劑、質粒回收試劑和內毒素去除試劑；

其中，菌體裂解試劑分為試劑一和試劑二，內毒素去除試劑分為試劑A和試劑B；按體積比，各個試劑的體積比例為：菌體裂解試劑的試劑一：菌體裂解試劑的試劑二：雜質去除試劑：質粒回收試劑：內毒素去除試劑的試劑A：內毒素去除試劑的試劑B＝(10～30):(10～30):20:20:30:7。

所述的菌體裂解試劑包括試劑一和試劑二，其中，按體積比，試劑一：試劑二＝1：1；試劑一為含有Tris-HCl和EDTA的水溶液，在試劑一中，Tris-HCl的摩爾濃度為40～60mmol/L，EDTA的摩爾濃度為8～15mmol/L；試劑二為含有氫氧化鈉和SDS的混合水溶液；在試劑二中，氫氧化鈉的摩爾濃度為0.1～0.3mol/L，SDS的質量濃度為0.5～2％。

所述的雜質去除試劑為含有乙酸﹑醋酸鉀﹑氯化鈣﹑氯化錳和鹽酸胍的水溶液，其中，在雜質去除試劑中，乙酸的摩爾濃度為1.8mol/L，醋酸鉀的摩爾濃度為0.42mol/L，氯化鈣的摩爾濃度為0.42mol/L，氯化錳的摩爾濃度為0.66mol/L，鹽酸胍的摩爾濃度為0.52mol/L。

所述的質粒回收試劑為含有聚乙二醇8000和二甲基亞砜的水溶液，其中，在質?；厥赵噭┲?，聚乙二醇8000的質量濃度為20～30％，二甲基亞砜的體積濃度為25～30％。