[發明專利]一種甲狀腺癌輔助分子診斷試劑盒及使用方法

在審

• 申請號: 202010559184.0
• 申請日: 2020-06-18
• 公開（公告）號: CN111534599A
• 公開（公告）日: 2020-08-14
• 發明（設計）人: 孫松松;韓勛領;羅鋒
• 申請（專利權）人: 重慶浦洛通基因醫學研究院有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/6858
• 代理公司: 重慶智慧之源知識產權代理事務所(普通合伙) 50234
• 代理人: 孫方

1.一種甲狀腺癌輔助分子診斷試劑盒，其特征在于：包括用于檢測BRAF、HRAS、KRAS、NRAS和TERT基因的擴增引物及探針、內控基因ACTB引物及探針、外控基因BRAF引物及探針；所述引物具體檢測的是BRAF基因的V600E位點、HRAS基因的Q61R位點、KRAS基因的G12C位點、KRAS基因的G12D位點、KRAS基因的G13R位點、KRAS基因的G13D位點、NRAS基因的Q61K位點、NRAS基因的Q61P位點、NRAS基因的Q61H1位點、NRAS基因的Q61H2位點、TERT基因的C228T位點和TERT基因的C250T位點。

2.如權利要求1所述一種甲狀腺癌輔助分子診斷試劑盒，其特征在于：所述用于檢測BFAR基因V600E的擴增引物對和探針序列如SEQ ID NO.1-3所示，所述用于檢測HRAS基因Q61R的擴增引物對和探針序列如SEQ ID NO.4-6所示，所述用于檢測KRAS基因G12C的擴增引物對和探針序列如SEQ ID NO.7-9所示，所述用于檢測KRAS基因G12D的擴增引物對和探針序列如SEQ ID NO.10-12所示，所述用于檢測KRAS基因G13R的擴增引物對和探針序列如SEQ ID NO.13-15所示，所述用于檢測KRAS基因G13D的擴增引物對和探針序列如SEQ IDNO.16-18所示，所述用于檢測NRAS基因Q61K的擴增引物對和探針序列如SEQ ID NO.19-21所示，所述用于檢測NRAS基因Q61P的擴增引物對和探針序列如SEQ ID NO.22-24所示，所述用于檢測NRAS基因Q61H1的擴增引物對和探針序列如SEQ ID NO.25-27所示，所述用于檢測NRAS基因Q61H2的擴增引物對和探針序列如SEQ ID NO.28-30所示，所述用于檢測TERT基因C228T的擴增引物對和探針序列如SEQ ID NO.31-33所示，所述用于檢測TERT基因C250T的擴增引物對和探針序列如SEQ ID NO.34-36所示。

3.如權利要求1所述一種甲狀腺癌輔助分子診斷試劑盒，其特征在于：所述內控基因ACTB引物及探針序列如SEQ ID NO.37-39所示，所述外控基因BRAF引物及探針序列如SEQID NO.40-42所示。

4.如權利要求1所述一種甲狀腺癌輔助分子診斷試劑盒，其特征在于：所述試劑盒還包括陽性質控品和陰性質控品，所述陽性質控品的獲取方法為：將所述檢測位點的序列信息通過人工合成，然后把該片段插入到T載體中，利用大腸桿菌DH5α菌株轉化并提取質粒，即為所述陽性質控品，所述陽性質控品的序列如SEQ ID NO.43-56所示。

5.如權利要求1所述一種甲狀腺癌輔助分子診斷試劑盒，其特征在于：所述試劑盒還包括PCR反應液，所述PCR反應液包含pH8.3的Tris-HCl 20mM，KCl 100mM，Mg²⁺2mM，dNTPs0.4mM，熱啟動Taq DNA聚合酶0.2U/μL。

6.一種根據權利要求1-5中任一項所述甲狀腺癌輔助分子診斷試劑盒的使用方法，包括以下步驟：

1)樣本制備：取待測樣本甲狀腺進行DNA提取，并調整DNA濃度到10ng/uL備用；

2)反應體系配置：分別由所述檢測位點的基因檢測試劑和內控檢測試劑形成PCR反應液1-11，同時形成外控檢測試劑的PCR反應液12，共同組成PCR反應體系；

3)PCR反應：PCR反應條件為：

預變性：95℃，2分鐘；

第一階段：由5個擴增循環構成，

變性：95℃，15秒；

退火：60℃，20秒；

延伸：72℃，20秒；

第二階段：由40個擴增循環構成，

變性：95℃，15秒；

退火：60℃，20秒，設置熒光信號采集；

延伸：72℃，20秒；

4)結果判讀。