[發(fā)明專利]豬星狀病毒間接ELISA檢測試劑盒

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010555543.5
• 申請(qǐng)日: 2020-06-17
• 公開（公告）號(hào): CN111551750B
• 公開（公告）日: 2023-10-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃偉堅(jiān);王蔚怡;劉歡;鄭瑞程;張文超
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣西大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N33/68
• 分類號(hào): G01N33/68;G01N33/58;G01N33/569;G01N33/543;C12N15/70;C12N15/40
• 代理公司: 廣西南寧公平知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 45104
• 代理人: 楊立華

本發(fā)明公開了一種豬星狀病毒間接ELISA檢測試劑盒，包括預(yù)先包被的ELISA反應(yīng)板，預(yù)先包被的ELISA反應(yīng)板以豬星狀病毒Capside保守區(qū)蛋白(pGEX?4T?1?cap?1蛋白)作為包被抗原。試驗(yàn)證明，本發(fā)明豬星狀病毒間接ELISA檢測試劑盒，能準(zhǔn)確靈敏地檢測豬血清中的性抓個(gè)病毒抗體，從而對(duì)樣品進(jìn)行定性判斷。而且，樣品前處理過程簡單，耗時(shí)少，敏感性好，能同時(shí)檢測大量的樣品，樣品檢測成本遠(yuǎn)低于傳統(tǒng)的儀器檢測方法。綜上，本發(fā)明對(duì)解決大批量樣品的豬星狀病毒現(xiàn)場檢測技術(shù)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于豬星狀病毒檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種豬星狀病毒間接ELISA檢測試劑盒。

背景技術(shù)

近年來在國內(nèi)外的養(yǎng)殖場中，豬星狀病毒(porcine astrovirus，PAstV)常與其他腸道病毒混合感染引起仔豬腹瀉，并造成不小的經(jīng)濟(jì)損失。PAstV Capside可以刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，是研究檢測診斷試劑的首選蛋白。

豬星狀病毒的診斷較為常見的方法有流行病學(xué)、分子診斷及病毒分離診斷等，但這些方法中有的診斷時(shí)間較長，有的檢測結(jié)果不理想，有的不便于臨床大量檢測。ELISA方法具有快速定性和定量、靈敏度高、適用范圍廣、結(jié)果判定客觀、成本低和可同時(shí)進(jìn)行數(shù)千份樣品的檢測等優(yōu)點(diǎn)。目前，國內(nèi)外并沒有關(guān)于豬星狀病毒相關(guān)ELISA檢測試劑盒的產(chǎn)品報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種具有高特異性、高靈敏度、高準(zhǔn)確度、高精確度、操作簡單的星狀病毒間接ELISA檢測試劑盒，以便于實(shí)現(xiàn)豬星狀病毒的批量、快速血清學(xué)檢測。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

豬星狀病毒間接ELISA檢測試劑盒，包括預(yù)先包被的ELISA反應(yīng)板，預(yù)先包被的ELISA反應(yīng)板以豬星狀病毒Capside保守區(qū)蛋白作為包被抗原。

豬星狀病毒Capside保守區(qū)蛋白由序列表SEQ.ID.No.1的基因堿基序列編碼或者具有SEQ.ID.No.2的氨基酸序列。

上述豬星狀病毒間接ELISA檢測試劑盒，還包括標(biāo)準(zhǔn)陰性血清、標(biāo)準(zhǔn)陽性血清、辣根過氧化物酶HRP標(biāo)記山羊抗豬IgG、洗滌液、稀釋液、包被液、封閉液、底物液、終止液。

洗滌液和稀釋液均為PBST洗滌液；包被液為PH9.6 Na₂CO₃-NaHCO₃緩沖液；封閉液為5％胎牛血清；底物液為TMB顯色液；終止液為2mol/L的硫酸溶液。

洗滌液和稀釋液均為PBST洗滌液，按以下進(jìn)行配制：將準(zhǔn)確稱量的8g NaCl、0.2gKCl、2.9g Na₂HPO₄.12H₂O和0.2g KH₂PO₄充分溶解在800mL去離子水中，然后將pH值調(diào)節(jié)到7，然后加去離子水定容至1L，再加入500μL Tween-20；

包被液為pH9.6 Na₂CO₃-NaHCO₃緩沖液，按以下進(jìn)行配制：將1.59g Na₂CO₃和2.93gNaHCO₃加水充分溶解后，將pH調(diào)到9.6后，加去離子水定容為1L，即得；

底物液為TMB顯色液，包括TMB顯色A液和B液，使用前進(jìn)行1：1配制。

包被抗原按以下方法進(jìn)行制備：根據(jù)豬星狀病毒全長感染性克隆質(zhì)粒為模板，利用設(shè)計(jì)合成的特異性引物對(duì)豬星狀病毒I型Capsid基因保守區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并將目的基因回收連接到pGEX-4T-1質(zhì)粒中，經(jīng)鑒定后轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，IPTG誘導(dǎo)后采用SDS-PAGE分析蛋白質(zhì)的表達(dá)情況；親和層析法分離純化得到目的蛋白pGEX-4T-1-cap-1蛋白。