[發(fā)明專利]一種快速檢測(cè)保健品中西地那非的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010554891.0
• 申請(qǐng)日: 2020-06-17
• 公開（公告）號(hào): CN112098653A
• 公開（公告）日: 2020-12-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 譚貴良;張世偉;胡敏;李向麗;李雪雁;李梅
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 電子科技大學(xué)中山學(xué)院;深圳市計(jì)量質(zhì)量檢測(cè)研究院
• 主分類號(hào): G01N33/58
• 分類號(hào): G01N33/58;G01N33/577;G01N33/558
• 代理公司: 中山馳鼎專利商標(biāo)代理事務(wù)所(普通合伙) 44706
• 代理人: 凌信景

1.一種快速檢測(cè)保健品中西地那非的方法，其特征在于包括如下步驟：

A、免疫原的合成,分別取西地那非免疫半抗原和西地那非包被半抗原，采用活潑酯法，將半抗原分別偶聯(lián)于載體蛋白BSA和OVA，獲得免疫原AT-BSA和包被原ATA-OVA，并通過紫外掃描鑒定半抗原與BSA和/或OVA是否偶聯(lián)成功；

B、篩選西地那非單克隆抗體,將免疫原免疫實(shí)驗(yàn)BALB/C小鼠后，取小鼠脾臟B細(xì)胞與瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，通過單克隆細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行篩選，并植入小鼠腹腔產(chǎn)生腹水,收集腹水后，通過Protein A柱進(jìn)行分離純化，凍干長(zhǎng)期保存；

C、制備西地那非抗體-熒光微球偶聯(lián)物，采用保護(hù)親和位點(diǎn)法標(biāo)記熒光微球，將氨基西地那非偶聯(lián)于含醛基活化的瓊脂糖凝膠上后，用氰基硼氫化鈉還原所形成的不穩(wěn)定碳氧雙鍵，將西地那非抗體和偶聯(lián)完成的瓊脂糖凝膠混合，室溫孵育后，裝入離心柱，離心去除未結(jié)合的抗體，使用磷酸鹽緩沖液PBS分多次洗滌凝膠；將以聚苯乙烯為材質(zhì)的熒光微球加入到磷酸鹽緩沖液PBS中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺進(jìn)行活化，然后加入含瓊脂糖凝膠的離心柱中，渦旋混勻，靜置室溫孵育后離心去除液體；使用甘氨酸鹽酸緩沖液作為洗脫液淋洗瓊脂糖凝膠；洗脫液立即用氫氧化鈉調(diào)節(jié)至pH 7.0，得到標(biāo)記好的西地那非抗體-熒光微球偶聯(lián)物；

D、構(gòu)建熒光微球?qū)游鲈嚰垪l，首先將樣本墊浸泡于磷酸緩沖液中，于55-70℃干燥；將包被原和羊抗鼠多抗噴涂于NC膜上，分別作為西地那非試紙條檢測(cè)線和質(zhì)控線，檢測(cè)線即T線，質(zhì)控線即C線，于30-40℃真空干燥，結(jié)合墊噴有西地那非抗體偶聯(lián)熒光微球，室溫真空干燥，最后將吸水紙、NC膜、結(jié)合墊和經(jīng)過預(yù)處理的樣本墊順序粘貼在PVC底板上，用自動(dòng)切條機(jī)切成試紙條，室溫條件下真空干燥，備用，即得到熒光微球?qū)游鲈嚰垪l；

E、建立定量曲線，將陰性條件下，T線熒光信號(hào)記為FIT，C線熒光信號(hào)記為FIC，F(xiàn)IT/FIC值記為B₀，西地那非標(biāo)準(zhǔn)溶液的FIT/FIC記為B，以B/B₀為縱坐標(biāo)，西地那非標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，使用Origin 8.0建立四參數(shù)擬合曲線，以B/B₀在0.2～0.8的標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)建立基于最小二乘法的線性回歸方程。

F、方法穩(wěn)定性評(píng)價(jià)，選取色譜確證為西地那非陰性的保健品樣品，西地那非加標(biāo)量為0.3-1mg/kg，使用同批和不同批次熒光試紙條連續(xù)多天對(duì)加標(biāo)和未加標(biāo)樣品其進(jìn)行測(cè)定；

G、樣品比對(duì)觀察，即通過對(duì)待測(cè)樣品和標(biāo)準(zhǔn)系列中西地那非的熒光微球免疫層析條抑制情況進(jìn)行肉眼直接比對(duì)觀察。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種快速檢測(cè)保健品中西地那非的方法，其特征在于所述步驟C中，將2mL 5mg/mL的西地那非抗體和2mL上述偶聯(lián)完成的瓊脂糖凝膠混合，室溫孵育10min后，裝入離心柱，離心去除未結(jié)合的抗體，使用6mL 0.01mol/L pH 7.4的磷酸鹽緩沖液PBS分3次洗滌凝膠；將0.2mg的熒光微球加入到2.7mL，0.01mol/L PBS中，加入1.0mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺進(jìn)行活化，然后加入含瓊脂糖凝膠的離心柱中，渦旋混勻，靜置室溫孵育1h后離心去除液體；使用4mL 0.1mol/L pH 3.0的甘氨酸鹽酸緩沖液作為洗脫液分兩次淋洗瓊脂糖凝膠；洗脫液立即用0.1mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)至pH 7.0，得到標(biāo)記好的西地那非抗體-熒光微球偶聯(lián)物。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種快速檢測(cè)保健品中西地那非的方法，其特征在于所述步驟D中，將樣本墊浸泡于20mmol/L磷酸緩沖液中，于60℃干燥2h；將2.5mg/mL包被原和0.3mg/mL的羊抗鼠多抗噴涂于NC膜上，分別作為西地那非試紙條檢測(cè)線和質(zhì)控線，檢測(cè)線即T線，質(zhì)控線即C線，于37℃真空干燥12h，結(jié)合墊噴有西地那非抗體偶聯(lián)熒光微球，室溫真空干燥12h，最后將吸水紙、NC膜、結(jié)合墊和經(jīng)過預(yù)處理的樣本墊順序粘貼在PVC底板上，用自動(dòng)切條機(jī)切成4mm寬的試紙條，室溫條件下真空干燥，備用，即得到熒光微球?qū)游鲈嚰垪l。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種快速檢測(cè)保健品中西地那非的方法，其特征在于所述步驟F中，西地那非加標(biāo)量為0.5mg/kg，使用同批和不同批次熒光試紙條連續(xù)6d對(duì)加標(biāo)和未加標(biāo)樣品其進(jìn)行測(cè)定。