[發(fā)明專利]活細胞內同時可視化基因的DNA、mRNA和蛋白的標簽及方法有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 202010553835.5 | 申請日： | 2020-06-17 |
| 公開（公告）號： | CN111718931B | 公開（公告）日： | 2021-12-07 |
| 發(fā)明（設計）人： | 陳寶惠;徐海月;鄒煒 | 申請（專利權）人： | 浙江大學 |
| 主分類號： | C12N15/11 | 分類號： | C12N15/11;C12N15/113;C12N15/90;C12N15/867;C12N15/66;C12N15/65;C12N9/22;C12N5/10 |
| 代理公司： | 杭州求是專利事務所有限公司 33200 | 代理人： | 林超 |
| 地址： | 310058 浙江*** | 國省代碼： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 細胞內 同時 可視化 基因 dna mrna 蛋白 標簽 方法 | ||
1.一種活細胞內同時可視化基因的DNA、mRNA和蛋白的TriTag標簽，其特征在于：由三個部分的DNA序列構成：
CRISPR-Tag DNA序列，由12個TS1重復單元組成的TS112x DNA序列，如SEQ ID No.1；
MS2 DNA序列，由12個MS2V5單元序列組成，如SEQ ID No.2；
含有內含子的藍色熒光蛋白序列，如SEQ ID No.5，是由如SEQ ID No.3的藍色熒光蛋白序列中插入一段如SEQ ID No.4的內含子序列后構成；
所述的TriTag標簽是由12個TS1重復單元序列和12個MS2V5單元序列交替穿插形成如SEQ ID No.6的DNA/RNA雙可視化序列，然后將該雙可視化序列通過酶切連接方法插入至含有內含子的藍色熒光蛋白序列中的內含子中而形成如SEQ ID No.7的TriTag標簽。
2.一種活細胞內同時可視化基因的DNA、mRNA和蛋白的方法，其特征在于：
（一）制備構建如權利要求1所述的TriTag標簽；
（二）采用TriTag標簽進行活細胞內同時可視化目標內源基因的DNA、mRNA和蛋白；
（1）構建可視化穩(wěn)定細胞系：
（1.1）當日，將HEK293T細胞用無PS培養(yǎng)基培養(yǎng)并鋪至12孔板中形成第一細胞培養(yǎng)基；
（1.2）次日，進行慢病毒包裝：用75 μl的減血清培養(yǎng)基Opti-medium預混各750 ng的dCas9-GFP14x病毒表達質粒和stdMCP-tdTomato病毒表達質粒、705 ng的pCMV-dR8.91質粒與87 ng的PMD2.G質粒后，再加入4.5 μl的Fugene瞬時轉染試劑Promega形成脂質體，滴加至第一細胞培養(yǎng)基的上清中，對第一細胞培養(yǎng)基中的HEK293T細胞進行瞬時轉染；
（1.3）在步驟（1.2）瞬時轉染的12小時后，吸掉第一細胞培養(yǎng)基上清，將第一細胞培養(yǎng)基更換新鮮培養(yǎng)基；
（1.4）在步驟（1.2）瞬時轉染的48小時后，對待感染細胞進行培養(yǎng)并鋪至24孔板中形成第二細胞培養(yǎng)基；
（1.5）形成第二細胞培養(yǎng)基24小時后，吸取步驟（1.3）更換新鮮培養(yǎng)基獲得的第一細胞培養(yǎng)基上清，然后置于離心機中以800 g轉速離心8分鐘，離心后取上清，提取出含有病毒的細胞上清；
（1.6）配制含濃度為5 μg/mL 的基因轉染增強劑polybrene的無PS培養(yǎng)基作為第三培養(yǎng)基以替換第二細胞培養(yǎng)基，使得待感染細胞培養(yǎng)轉移到第三培養(yǎng)基，然后取30-90 μl的含有病毒的細胞上清滴加感染至待感染細胞的第三培養(yǎng)基上清中；
（1.7）在步驟（1.6）感染的12小時后，對第三培養(yǎng)基更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，直至可傳代至8孔板中進行顯微鏡成像觀察，并根據(jù)熒光強度和感染效率篩選出細胞感染群體，進行96孔板單細胞克隆的分離；
（1.8）待96孔板單孔中細胞長至細胞群狀態(tài)，顯微鏡下觀察熒光強弱，進行單細胞克隆的篩選；
（2）穩(wěn)定細胞系中構建包含有TriTag標簽的目標內源基因可視化體系并轉染分選；
（3）同時可視化目標內源基因的DNA、mRNA和蛋白并活細胞動態(tài)成像。
3.根據(jù)權利要求2所述的一種活細胞內同時可視化基因的DNA、mRNA和蛋白的方法，其特征在于：所述步驟（一）具體如下：
S1、設計并構建含有內含子的藍色熒光蛋白序列：
采用人HSPA5基因的第4內含子序列，在該內含子序列中加入BstXI限制性酶切位點通過核酸合成的方式直接合成；
S2、設計并合成DNA/RNA雙可視化序列：通過核酸合成的方式將12個TS1重復單元序列和12個MS2V5單元序列交替穿插12次合成；
S3、TriTag標簽的組建：利用酶切連接方法將DNA/RNA雙可視化序列插入至含有內含子的藍色蛋白序列的內含子中獲得TriTag標簽。
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