[發明專利]用于α-地中海貧血多重實時熒光PCR檢測的引物、探針和反應緩沖液組合及試劑盒

有效

• 申請號: 202010552793.3
• 申請日: 2020-06-17
• 公開（公告）號: CN111471763B
• 公開（公告）日: 2023-06-02
• 發明（設計）人: 魏劭;林培蕊;雷彩霞;魏超
• 申請（專利權）人: 廈門安普利生物工程有限公司;南京安浦精準醫學檢驗有限公司
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12Q1/6858;C12Q1/6834;C12N15/11
• 代理公司: 北京高沃律師事務所 11569
• 代理人: 董大媛

1.用于α-地中海貧血多重實時熒光PCR檢測的試劑盒，由用于α-地中海貧血多重實時熒光PCR檢測的引物、探針和反應緩沖液組合而成，所述組合包括8組引物和探針組合以及4種反應緩沖液；所述4種反應緩沖液包括B-4反應緩沖液、B-2反應緩沖液、J-1反應緩沖液和H-1反應緩沖液；所述8組引物和探針組合包括第1組引物和探針組合～第8組引物和探針組合；所述第1組引物和探針組合～第8組引物和探針組合分別單獨包裝；所述B-4反應緩沖液、B-2反應緩沖液、J-1反應緩沖液和H-1反應緩沖液分別單獨包裝；

所述第1組引物和探針組合包括：SEA上游引物、SEA下游引物、SEA探針、內標01上游引物、內標01下游引物和內標01探針；所述SEA上游引物、SEA下游引物和SEA探針的核苷酸序列分別如SEQ?ID?NO.1～SEQ?ID?NO.3所示；所述內標01上游引物、內標01下游引物和內標01探針的核苷酸序列分別如SEQ?ID?NO.28～SEQ?ID?NO.30所示；

第2組引物和探針組合包括：THAI上游引物、THAI下游引物、THAI探針、內標01上游引物、內標01下游引物和內標01探針；所述THAI上游引物、THAI下游引物和THAI探針的核苷酸序列分別如SEQ?ID?NO.4～SEQ?ID?NO.6所示；所述內標01上游引物、內標01下游引物和內標01探針的核苷酸序列分別如SEQ?ID?NO.28～SEQ?ID?NO.30所示；

第3組引物和探針組合包括：4.2A上游引物、4.2A下游引物、4.2A探針、內標03上游引物、內標03下游引物和內標03探針；所述4.2A上游引物、4.2A下游引物和4.2A探針的核苷酸序列分別如SEQ?ID?NO.7～SEQ?ID?NO.9所示；所述內標03上游引物、內標03下游引物和內標03探針的核苷酸序列分別如SEQ?ID?NO.34～SEQ?ID?NO.36所示；

第4組引物和探針組合包括：4.2B上游引物、4.2B下游引物、4.2B探針、內標02上游引物、內標02下游引物和內標02探針；所述4.2B上游引物、4.2B下游引物和4.2B探針的核苷酸序列分別如SEQ?ID?NO.10～SEQ?ID?NO.12所示；所述內標02上游引物、內標02下游引物和內標02探針的核苷酸序列分別如SEQ?ID?NO.31～SEQ?ID?NO.33所示；

第5組引物和探針組合包括：3.7上游引物、3.7下游引物、3.7探針、內標02上游引物、內標02下游引物和內標02探針；所述3.7上游引物、3.7下游引物和3.7探針的核苷酸序列分別如SEQ?ID?NO.13～SEQ?ID?NO.15所示；所述內標02上游引物、內標02下游引物和內標02探針的核苷酸序列分別如SEQ?ID?NO.31～SEQ?ID?NO.33所示；

第6組引物和探針組合包括：WS上游引物、WS下游引物、第一WS探針、第二WS探針、內標01上游引物、內標01下游引物和內標01探針；所述WS上游引物、WS下游引物、第一WS探針和第二WS探針的核苷酸序列分別如SEQ?ID?NO.16～SEQ?ID?NO.19所示；所述內標01上游引物、內標01下游引物和內標01探針的核苷酸序列分別如SEQ?ID?NO.28～SEQ?ID?NO.30所示；

第7組引物和探針組合包括：QS上游引物、QS下游引物、第一QS探針、第二QS探針、內標01上游引物、內標01下游引物和內標01探針；所述QS上游引物、QS下游引物、第一QS探針和第二QS探針的核苷酸序列分別如SEQ?ID?NO.20～SEQ?ID?NO.23所示；所述內標01上游引物、內標01下游引物和內標01探針的核苷酸序列分別如SEQ?ID?NO.28～SEQ?ID?NO.30所示；

第8組引物和探針組合包括：CS上游引物、CS下游引物、第一CS探針、第二CS探針、內標01上游引物、內標01下游引物和內標01探針；所述CS上游引物、CS下游引物、第一CS探針和第二CS探針的核苷酸序列分別如SEQ?ID?NO.24～SEQ?ID?NO.27所示；所述內標01上游引物、內標01下游引物和內標01探針的核苷酸序列分別如SEQ?ID?NO.28～SEQ?ID?NO.30所示；

所述SEA探針、THAI探針、4.2A探針、4.2B探針、3.7探針、第二WS探針、第二QS探針和第二CS探針的5’端分別標記有熒光報告基團FAM，3’端分別標記有淬滅基因BHQ1；

所述第一WS探針、第一QS探針和第一CS探針的5’端分別標記有熒光報告基團ROX，3’端分別標記有淬滅基因BHQ2；

所述內標01探針、內標02探針和內標03探針的5’端分別標記有熒光報告基團HEX，3’端分別標記有淬滅基因BHQ1；

所述B-4反應緩沖液包括以下濃度的組分：三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽3.8mM、三羥甲基氨基甲烷32.2mM、氯化鉀150mM、氯化鎂6.25mM、曲拉通0.25％、硫酸銨12.5mM、脫氧核糖核苷三磷酸0.75mM和脫氧尿苷三磷酸1.5mM；

所述B-2反應緩沖液包括以下濃度的組分：三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽3.8mM、三羥甲基氨基甲烷32.2mM、氯化鉀150mM、氯化鎂6.25mM、曲拉通0.25％、硫酸銨12.5mM、四甲基氯化銨20mM、脫氧核糖核苷三磷酸0.75mM和脫氧尿苷三磷酸1.5mM；

所述J-1反應緩沖液包括以下濃度的組分：三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽3.8mM、三羥甲基氨基甲烷32.2mM、氯化鉀125mM、氯化鎂6.25mM、硫酸銨25mM、體積百分含量為12.50％的二甲基亞砜、甜菜堿2.5M、7-deaza-dGTP0.075mM、脫氧核糖核苷三磷酸1mM和脫氧尿苷三磷酸2mM；

所述H-1反應緩沖液包括以下濃度的組分：4-羥乙基哌嗪乙磺酸50mM、硫酸銨25mM、氯化鉀125mM、氯化鎂7.5mM、體積百分含量為2.50％的甲酰胺、脫氧核糖核苷三磷酸0.4mM和脫氧尿苷三磷酸0.8mM；

所述第1引物和探針組合～第3引物和探針組合分別和B-4反應緩沖液聯用；

所述第4引物和探針組合和B-2反應緩沖液聯用；

所述第5引物和探針組合和J-1反應緩沖液聯用；

所述第6引物和探針組合～第8引物和探針組合分別和H-1反應緩沖液聯用；

所述試劑盒還包括酶混合液、稀釋緩沖液、TE緩沖液和石蠟油；

所述試劑盒的每組引物和探針組合中，每種引物或者每種探針的使用母液濃度分別為50μM。