[發明專利]一種兩步法核酸擴增與檢測用的反應管

在審

• 申請號: 202010552780.6
• 申請日: 2020-06-17
• 公開（公告）號: CN111621412A
• 公開（公告）日: 2020-09-04
• 發明（設計）人: 駱志成;駱廣進;黃俊;樊偉東;俞彬榮;鄭利俊;張徐俞
• 申請（專利權）人: 杭州奧盛儀器有限公司
• 主分類號: C12M1/24
• 分類號: C12M1/24;C12M1/38;C12M1/34
• 代理公司: 杭州天勤知識產權代理有限公司 33224
• 代理人: 沈金龍

本發明公開了一種兩步法核酸擴增與檢測用的反應管，包括管體及與管體配合密封的蓋體，所述蓋體包括伸入所述管體中、與管體口部插接配合的塞子部，以及配合時位于管體外的操作部；所述蓋體的內部具有用于在第一步核酸擴增時暫時存放檢測試劑的儲存室，以及在核酸擴增完成后通過操作所述操作部將儲存室中檢測試劑釋放到管體中的釋放機構。本發明反應管使用時，由于核酸擴增時，儀器對反應管的加熱部位只在管體下部的區域，對管體的儲存室內暫存的檢測試劑影響較小，可以在開始時就將核酸擴增試劑與檢測試劑一起加入到相應區域，避免了二次開蓋，從而減少氣溶膠污染和假陽性問題，使整個檢測操作過程更簡單方便。

技術領域

本發明涉及生物技術檢測技術領域，特別是涉及一種兩步法核酸擴增與檢測用的反應管。

背景技術

核酸擴增檢測技術是開展分子生物學研究的基礎，可用于定性、定量地分析和檢測微量核酸，其在臨床醫學、檢驗醫學、分子生物學、基因組學及食品安全等相關的各個領域發揮著重要的作用，是生命科學發展不可或缺的一種重要檢驗方法。現有核酸擴增技術可根據是否需要溫度循環分為兩類：第一類為變溫擴增體系，包括聚合酶鏈式反應(Polymerase chain reaction，PCR)、連接酶鏈式反應(ligase chain reaction，LRC)等。其中PCR技術因其特異性強，靈敏度高，價格低廉等優點，是目前應用最為廣泛的核酸體外擴增技術。但該技術需要特定的儀器，同時對操作人員以及實驗條件有一定的專業要求。第二類為等溫擴增體系，包括環介導等溫擴增技術(Loop-mediated isothermalamplification，LAMP)、滾環擴增技術(Rolling Circle Amplification，RCA)以及重組酶聚合酶擴增技術(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)等，該技術無需熱循環過程，不需要特殊儀器，但其擴增易產生假陽性。

近年來，CRISPR技術的出現帶來了一種更簡便靈敏的檢測方式。其主要原理是利用Cas酶在體系中guide RNA的引導下與目標序列結合后，便會切換為激活狀態，高效的切割體系內其它的單鏈DNA。在體系內加入含有報告基團的單鏈DNA探針底物后，Cas蛋白識別到靶序列的存在，就會切割單鏈DNA探針底物從而釋放熒光報告基團產生熒光信號。在目前已知的利用CRISPR檢測的體系中，由于受到反應溫度的影響，CRISPR體系無法在起始時刻就添加到反應體系中，必須等到反應結束后二次開蓋再進行后續添加，極易造成嚴重的氣溶膠污染和假陽性問題，并且使得整個檢測操作過程變得復雜和繁瑣。

現有技術中，常用普通PCR管進行上述核酸擴增結合CRISPR檢測的雙系統耦聯方法，比如，授權公告號為CN205077049U的實用新型公開了一種PCR管、PCR管條、PCR管板的密封結構，包括有管體、管蓋，管蓋靠近底部的周向外表面上分別向外凸設有環形防脫安全凸扣、位于防脫安全凸扣下方的環形密封保險凸扣，防脫安全凸扣和密封保險凸扣分別緊密頂壓在管體的管口內側面上形成密封結構。

公開號為CN102534011A的發明公開了一種全密閉式靶核酸擴增產物快速熒光檢測方法和裝置，所述方法是擴增反應結束后，把反應管在不開蓋的情況下放入在密閉性的裝置內，在該密閉性裝置內反應管被破壁，使反應管內擴增產物與密閉裝置內預置的檢測液反應，然后進行熒光檢測，判讀結果。所述裝置包括PCR管、離心管和一頂針塞，所述PCR管能置于離心管中，所述頂針塞具有能刺破PCR管的穿刺針，離心管具有可密閉的管蓋。然而，該技術方案僅僅是用于PCR擴增結束后熒光檢測時避免了PCR反應產物以氣溶膠的形式擴散到空氣中，并不適用于核酸擴增結合CRISPR檢測的雙系統耦聯方法。且操作比較復雜，不能自動化操作，PCR管反應完成后再放入離心管中，PCR管經過長時間操作，外表面也容易沾染污染物，造成假陽性。并且，該技術方案中PCR管刺破過程不易控制，很可能在離心管蓋子還沒蓋合之前就已經將PCR管刺破，或者在離心管蓋子蓋合后還沒將PCR管刺破，造成對結果的影響。另外一方面，該技術方案中只能手動進行操作，而無法實現自動化操作。

發明內容