[發明專利]一種基于線粒體IGS56序列的哈蟆油真偽鑒定和定量方法

有效

• 申請號: 202010552026.2
• 申請日: 2020-06-16
• 公開（公告）號: CN111575389B
• 公開（公告）日: 2022-09-20
• 發明（設計）人: 楊勇;盧丹;李小清
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/6851;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 吉林長春新紀元專利代理有限責任公司 22100
• 代理人: 魏征驥

本發明提供一種基于線粒體IGS56序列的哈蟆油真偽鑒定和定量方法，屬于分子生物學檢測和定量領域。公開了線粒體IGS56序列特征以及三對相關引物的序列特征，用于名貴藥材哈蟆油真偽鑒定和定量分析的，IGS56序列為近源物種線粒體基因組序列比對中的高變異區域，首次實現了對近源物種來源的哈蟆油正偽品的鑒定，推廣的技術門檻較低，同時能快速、穩定地區分哈蟆油正品與相關偽品。進一步，本發明還公布了一種使用F3/R3引物對進行哈蟆油藥材定量分析的熒光定量PCR方法；該法特異性較高，相比藥典中現行高效液相色譜法在種屬特異性方面優勢明顯，本發明是對新版中國藥典記載及現有技術的合理補充，具有較強的應用前景。

技術領域

本發明涉及分子生物學檢測和定量領域，具體涉及一種蛤蟆油藥材的真偽鑒定的聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction,PCR)方法和一種定量分析的熒光定量PCR方法。

背景技術

哈蟆油(Ranae Oviductus)是1985年首次納入藥典的一味名貴藥材，為中國林蛙(Rana temporaria chensinensis David)雌蛙干燥輸卵管。自1985年首次納入至2020最新版藥典，哈蟆油基源動物的描述均沿用1938年至1940年Boring的歐洲林蛙(Ranatemporaria)中國林蛙亞種的命名方式。1940年，黑龍江林蛙(Rana amurensis)、中國林蛙(Rana chensinensis)和東北林蛙(Rana dybowskii)等均被歸入歐洲林蛙中國林蛙亞種。隨著中國林蛙亞種與歐洲林蛙在染色體數等方面的差異被發現，原中國林蛙亞種指代的黑龍江林蛙(R.amurensis)、中國林蛙(R.chensinensis)和東北林蛙(R.dybowskii)分別于1955年、1981年和1999年獨立成有效種，亞種命名方式已成為歷史。因此，中國藥典中持續使用亞種方式已嚴重滯后，在學術界引起長期爭議。因東北林蛙(R.dybowskii)在1985年尚未獨立成種，1985版中國藥典的中國林蛙亞種的命名方式指代的應為中國林蛙(R.chensinensis)和東北林蛙(R.dybowskii)，而非狹義的中國林蛙(R.chensinensis)。依據《本草圖經》、《本草綱目》以及《四庫全書》等經典古籍記載，哈蟆油最早主產于我國東北地區，結合我國目前哈蟆油的主產地也為東北地區，目前學術界很多學者建議將藥典中哈蟆油基源動物修改為東北林蛙(R.dybowskii)。因產地和產量的限制，市場上的哈蟆油的價格非常昂貴，存在較多偽品。主要偽品包括來源于黑龍江林蛙(R.amurensis)、桓仁林蛙(R.huanrensis)、青蛙(Rana nigromaculata)、牛蛙油(Rana catesbeianna)和中華大蟾蜍油(Bufo gargarizans)等蛙科動物來源的干燥輸卵管。

目前藥典中記載的哈蟆油鑒別和定量方法為高效液相色譜法檢測1-甲基海因。然而因1-甲基海因作為一種化學小分子，在蛙科動物中存在較為廣泛，特異性較差。近年來，特異性較強的DNA分子鑒定技術逐漸在中藥材鑒定領域應用。DNA條形碼(DNA barcoding)技術是首個于2010年納入藥典指導原則的中藥材分子鑒定方法，該法基于細胞色素C氧化酶亞基(COI)的編碼基因序列，借助于COI基因擴增和測序完成藥材分子鑒定。DNA條形碼在應用存在非特異性擴增、檢測時間較長(含測序環節)和檢測成本(含測序成本)和技術門檻較高(需分析測序結果)等明顯劣勢。部分國內學者采用特異性更強的聚合酶鏈式反應方法(PCR)在烏鞘蛇、蘄蛇、川貝母和金錢白花蛇等4味藥材中嘗試基于PCR技術的分子鑒定，并分別于2010年和2015年進入中國藥典。2020年新版中國藥典中新增聚合酶鏈式反應法通用技術要求(1001)，可見PCR方法進行中藥材分子鑒定呈現較好的前景。哈蟆油的分子鑒定方法尚未進入中國藥典，多個課題組(石林春等；王孟虎等)主要是基于COI基因測序建立DNA條形碼技術。也有其他學者(黃璐琦等)基于線粒體基因組另外一個編碼Cyt B的編碼區設計PCR方法進行鑒定。然而上述的現有分子鑒定技術中，僅涉及對蟾蜍、青蛙、黑龍江林蛙或者牛蛙等相對遠源的偽品進行鑒定，而缺乏針對中國林蛙、東北林蛙和桓仁林蛙在內的近源正偽品鑒別的方法。