[發明專利]3羥基根皮苷的制備及其工藝優化

在審

• 申請號: 202010551510.3
• 申請日: 2020-06-17
• 公開（公告）號: CN113801906A
• 公開（公告）日: 2021-12-17
• 發明（設計）人: 汪鋆植;余泇興;周子鍵
• 申請（專利權）人: 恩施硒海棠生物科技有限公司
• 主分類號: C12P19/44
• 分類號: C12P19/44
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明涉及3羥基根皮苷的制備及其工藝優化方法，其反應條件溫和，生產能耗小，環境污染少，可操作性強，步驟包括：取一定體積的粗酶液，加入合適比例的一定濃度的根皮苷溶液，于實驗要求溫度下水浴相應時間，沸水加熱5 min。確定的實際取值為根皮苷濃度1.20mM，轉化時間6.0h，粗酶濃度13.0 U*mL^?1。此條件下由公式計算的理論值為93%，得到3?羥基根皮苷的摩爾轉化率為92.5%±0.525%；取轉化液，用等體積甲醇稀釋，0.22μm的微孔濾膜過濾；采用HPLC分析濾液中的根皮苷和3?羥基根皮苷含量，并根據其標準曲線回歸方程計算含量；將上述所得反應液用大孔樹脂吸附，水洗去雜，然后用30?90%乙甲醇依次洗脫，收集含3?羥基根皮苷的組分，濃縮干燥得到黃色無定形粉末3?羥基根皮苷。

技術領域

本發明涉及一種微生物轉化根皮苷生產3羥基根皮苷的方法。

背景技術

湖北海棠原產地適應性極強，在我國廣為分布，但湖北西部連片分布，是湖北海棠原產地。是良好的可利用資源。具有藥用、食用、觀賞多種價值。衛生部2014年第20號公告批準湖北海棠（茶海棠）葉為新食品原料。《湖北省中藥材質量標準》2009年版收載了藥材質量標準。

湖北海棠葉作茶飲用已有千年歷史。含有根皮苷、3-羥基根皮苷、齊墩果酸、熊果酸等化合物。具有保肝、雌激素樣作用等多種作用。其作用是多種成分共同作用的結果。湖北海棠葉早期以根皮苷為主要成分。為了控制海棠茶內在成分比例，優化藥理作用。同時制備不同成分，進一步擴大湖北海棠的應用。我們發明了一種微生物轉化根皮苷生產3羥基根皮苷的方法。

發明內容

本發明的目的在于：控制海棠茶內在成分比例，優化藥理作用，同時制備不同成分，進一步擴大湖北海棠的應用。具體地提供了一種制備及其工藝優化方法：它包括如下操作步驟：

（1）粗酶的制備：

①菌種的擴大培養：取斜面菌種接種至平板培養基上，于25℃恒溫培養箱中培養7d，備用。

②菌種液體發酵：a.接種用菌懸液制備：將平板上菌種接種于裝有玻璃珠的200mL發酵培養基中，于30 ℃、120 r/min條件下，培養24 h，制得種子液;b.液體發酵：以5%的接種量吸取種子液至200 mL 發酵培養基中，于30 ℃、120 r/min條件下培養。

③粗酶獲得與酶活測定：a.粗酶：收集發酵液，過濾，棄去菌絲體，上清液用50%硫酸銨4℃下鹽析12h，在4℃于12 000 r/min離心30 min，棄去上清液，收集沉淀;沉淀加入少量去離子水，溶解，脫鹽，冷凍干燥得到粗酶;b.多酚氧化酶活性測定：粗酶用適宜緩沖液溶解，取1mL粗酶液+2mL0.1mol/L的pH6.5磷酸鹽緩沖液+3mL反應液（pH6.5緩沖液：0.1%脯氨酸：0.1M鄰苯二酚=10:2:3），37℃，反應10min，以每分鐘OD₄₂₀值增加0.001為一個酶活力單位，以沸水浴滅活1mL粗酶液+2mL 0.1mol/L的pH6.5磷酸緩沖液+3mL反應液同步反應做空白。

（2）根皮苷的生物轉化方法：取上述一定體積的粗酶液，按照實驗設計加入合適比例的一定濃度的根皮苷溶液，于實驗要求溫度下水浴相應時間，沸水加熱5 min，以終止反應。

（3）取轉化液，用等體積甲醇稀釋， 0.22 μm的微孔濾膜過濾；采用HPLC分析濾液中的根皮苷和3-羥基根皮苷含量，并根據他們的標準曲線回歸方程計算含量；實驗中，同時設立對照組，即只加轉化液，不加底物。

（4）分離純化：將上述所得反應液用大孔樹脂吸附，水洗去雜，然后用30-90%乙甲醇依次洗脫，收集含3-羥基根皮苷的組分，濃縮干燥得到黃色無定形粉末3-羥基根皮苷。