[發(fā)明專利]檢測炭疽病菌對QOI類殺菌劑抗藥性的組合物及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010550061.0
• 申請日: 2020-06-16
• 公開（公告）號: CN111733271B
• 公開（公告）日: 2022-02-22
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 閆曉靜;陳淑寧;袁會珠;楊代斌;孔繁芳
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/645
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11246
• 代理人: 陳波

本發(fā)明公開了屬于植物病原菌抗藥性檢測技術(shù)領(lǐng)域的一種檢測炭疽病菌對QoI類殺菌劑抗藥性的組合物及其應(yīng)用。所述組合物，包括引物組合，所述引物組合包括兩對引物，分別為外引物和內(nèi)引物。本發(fā)明的引物和試劑盒應(yīng)用環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增技術(shù)，使檢測平頭炭疽病菌對QoI類殺菌劑的抗藥性不需要昂貴的PCR儀器，在田間條件下就能快速、準(zhǔn)確檢測大量樣本，使在噴施殺菌劑前快速檢測田間病原菌是否已經(jīng)產(chǎn)生抗藥性成為可能。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于植物病原菌抗藥性檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測炭疽病菌對甲氧基丙烯酸酯(QOI)類殺菌劑抗藥性的組合物及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

平頭炭疽病菌(Colletotrichum truncatum)是一種重要的植物病原菌，可以侵染的寄主幾乎囊括所有作物(Dean,R.,Van Kan,J.A.,Pretorius,Z.A.,Hammond-Kosack,K.E.,Di Pietro,A.,Spanu,P.D.,Rudd,J.J.,Dickman,M.,Kahmann,R.,Ellis,J.,2012.The Top 10fungal pathogens in molecular plant pathology.Molecular plantpathology 13:414-430.)，是引起植物病害最重要的病原菌之一，對水果、蔬菜、谷類及觀賞植物等重要經(jīng)濟(jì)作物，均能造成嚴(yán)重的采前采后危害(Cannon,P.,Damm,U.,Johnston,P.,Weir,B.,2012.Colletotrichum–current status and future directions.Studiesin mycology73:181-213.)，在我國是造成大豆炭疽病和辣椒炭疽病的優(yōu)勢種。

目前使用殺菌劑在是控制該病的主要手段。對于炭疽病的防治，生產(chǎn)上常用甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑(QoIs)進(jìn)行防治。該類藥劑能夠有效控制子囊菌、擔(dān)子菌、半知菌和卵菌為害的廣譜性殺菌劑。其代表藥劑為嘧菌酯，主要作用是抑制孢子萌發(fā)，游動孢子的釋放和游動，具有極高活性。但該類藥劑較易產(chǎn)生抗藥性問題，其抗性已在數(shù)十種不同植物病原菌中報道。就炭疽病菌而言，在C.cereal,C.gloeosporiodes,C.graminicola，C.acutatum中均有QoI類藥劑抗性的報道。

若在噴藥前就能明確田間是否已產(chǎn)生了抗性菌株，就可以準(zhǔn)確制定殺菌劑噴施計劃。目前比較常用的檢測方法包括兩種，即以菌絲生長抑制為基礎(chǔ)的傳統(tǒng)的菌落直徑法和基于目標(biāo)基因的PCR技術(shù)或測序技術(shù)。傳統(tǒng)的菌落直徑法需要采集田間菌株，進(jìn)行單孢分離，然后在添加一系列濃度的農(nóng)藥培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，檢測農(nóng)藥對菌絲生長的效應(yīng)，根據(jù)EC₅₀(抑制中濃度)或MIC(最低抑制濃度)鑒別抗藥性，一般以10mg/L作為區(qū)分QoI類殺菌劑抗性和敏感菌株的標(biāo)準(zhǔn)。傳統(tǒng)的菌絲對藥劑的敏感性測定方法通常需要幾周時間，工作量大，測定樣本數(shù)量有限，要求嚴(yán)格的無菌操作，難以在早期就發(fā)現(xiàn)抗藥性菌株的存在。而目前基于一般PCR技術(shù)的檢測方法，所需儀器價格昂貴，對操作人員的技術(shù)要求較高，不適合在田間或者地市縣等農(nóng)業(yè)部門推廣。

發(fā)明內(nèi)容

針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的第一個目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)檢測周期長，工作量大，需要無菌條件，及PCR技術(shù)對儀器和人員技術(shù)要求高的缺陷，提供一種檢測炭疽病菌對QOI類殺菌劑抗藥性的組合物，此組合物可以用于結(jié)果判斷直觀且可在田間操作的平頭炭疽抗藥性檢測方法。

上述組合物，包括引物組合，所述引物組合包括兩對引物，分別為外引物和內(nèi)引物；

所述外引物為：

CtF:TGGGTATAGGTTTCTTAGGTTA；

CtB:GCATTAATACTAATGCGGCTAA；

所述內(nèi)引物為：

CtFIP:

TGTCCAATTCAAGGTATAGCACTT-GGACAAATGTCATTATGAGCT；