[發明專利]一種豬肺炎支原體培養基及其制備方法與應用

在審

• 申請號: 202010548417.7
• 申請日: 2020-06-16
• 公開（公告）號: CN111635876A
• 公開（公告）日: 2020-09-08
• 發明（設計）人: 徐高原;顧偉;陳關平;周明光;曹毅;韓進;田蘇英;喻慧芳;金建云
• 申請（專利權）人: 武漢科前生物股份有限公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12R1/35
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 陳征

本發明涉及微生物技術領域，具體公開了一種豬肺炎支原體培養基及其制備方法與應用。本發明的豬肺炎支原體培養基，包括肌醇，并進一步包括配合所述肌醇添加的PPLO肉湯、腦心浸粉、胰蛋白胨和丙酮酸鈉。本發明發現，當在豬肺炎支原體培養基中加入肌醇，并配合特定的營養物質選擇時，可部分替代血清在培養基中的作用，從而在降低血清用量的情況下，仍提升了增殖效率，實現了低血清下的高密度培養。極大地降低了生產成本，提高了產品純度，減輕了血清對豬體的過敏應激反應，提高了抗原的效價，適于應用于豬肺炎支原體疫苗的生產。

技術領域

本發明涉及微生物技術領域，具體地說，涉及一種豬肺炎支原體培養基及其制備方法與應用。

背景技術

豬支原體肺炎，又稱地方流行性肺炎，是一種慢性呼吸道疾病,其原發病原是豬肺炎支原體和其它呼吸道病原，如豬鼻支原體、豬胸膜肺炎放線桿菌、副豬嗜血桿菌、豬源支氣管敗血波氏桿菌、多殺巴氏桿菌等也經常繼發感染，豬支原體肺炎病是一種分布廣泛的豬呼吸道疾病，其特點是發病率高，流行廣并難以凈化。長期以來，對養豬業造成重大經濟損失，有研究顯示，自然感染該病的病豬生長率降低了12.7％，在哺乳期接種母豬自然感染仔豬的實驗中，患病小豬的生長率降低了15.9％，飼料轉化率降低了13.8％，使飼料成本增加并延長了飼養期，導致了生產成本的增加。本病雖為老病，但近年來由于經常和PRRS、圓環病毒等其它病原混合感染，造成了更嚴重的損失。因此，有必要對其進行大量研究。

目前，培養豬肺炎支原體培養基有很多種，有煮沸豬肺組織的滅活細胞培養基，豬肺埋塊無細胞培養基，江蘇省農業科學院創造的KM2培養基以及以腦心浸粉和PPLO肉湯為主要原料的豬肺炎支原體培養基。上述支原體培養存在培養難度大，血清需求量大等問題。現有專利所描述的培養基還普遍存在原材料成本高，培養基配制繁瑣以及原材料成分復雜和各批次間穩定性差等問題，是目前支原體疫苗規模化生產亟需解決的問題。

發明內容

針對現有技術的不足，本發明的目的是提供一種可在低血清下實現高效豬肺炎支原體培養的培養基。

為了實現該目的，本發明的技術方案如下：

一種豬肺炎支原體培養基，所述培養基包括肌醇，并進一步包括配合所述肌醇添加的PPLO肉湯、腦心浸粉、胰蛋白胨和丙酮酸鈉。

豬肺炎支原體作為最小的原核微生物，其基因組小且數量有限，從而導致生物合成途徑缺乏，需要從外界攝取氨基酸、糖類、微量元素等多種物質，還需加入較高量的動物血清才能保證其高效增殖。而血清用量高，增加了培養成本及豬的過敏風險，且在后續用于生產豬肺炎支原體疫苗時，易影響抗原效價。本發明經大量研究發現，當在豬肺炎支原體培養基中加入肌醇，并配合特定的營養物質選擇時，可部分替代血清在培養基中的作用，從而在降低血清用量的情況下，仍提升了增殖效率，實現了低血清下的高密度培養。若改變本申請的該組合方式，則效果不理想。

優選的，所述豬肺炎支原體為豬肺炎支原體J株。

本發明中，所述肌醇的質量與所述PPLO肉湯、所述腦心浸粉、所述胰蛋白胨和所述丙酮酸鈉的總質量之比為1：(10～60)，優選為：1：(50-55)；更優選1：53。以本發明的特定比例配合，培養基碳氮源搭配更合理，豬肺炎支原體在該培養基組合培養下所得CCU高，同時培養基來源明確，批間次差異小，配制簡便，價格低廉。

本發明中，所述PPLO肉湯、所述腦心浸粉、所述胰蛋白胨和所述丙酮酸鈉的質量之比為(5～30)：(1～10)：(5～20)：(1～10)，優選為：(28～30)：(1～3)：(18～20)：(1～3)，更優選為：30：1：20：2；該培養基組合成本低，并且培養所得生物量高。

與肌醇配合的各組分之間，在以本發明的配比進行組合后，可更好地平衡培養基組分對豬肺炎支原體的促生作用，保證低血清下的高效培養效果。

本發明中，培養基還包括3～10％(V/V)的血清，優選為3％。