[發(fā)明專利]一種酸土脂環(huán)酸芽胞桿菌的分子檢測方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202010548016.1
• 申請日: 2020-06-16
• 公開（公告）號: CN111662961A
• 公開（公告）日: 2020-09-15
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 馬曉燕;張偉;張?zhí)N哲;張先舟;苑寧;楊粵
• 申請（專利權(quán)）人: 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844;C12Q1/689;C12R1/01
• 代理公司: 石家莊圖歌知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 13136
• 代理人: 李青

1.一種酸土脂環(huán)酸芽胞桿菌的分子檢測方法，其特征在于，在Bca DNA聚合酶和RNaseH酶的作用下，在60～65℃的溫度下，SPIA的擴增反應(yīng)僅需要一條混合引物即可完成，具體包括如下步驟：

步驟1：反應(yīng)開始時，混合引物和鏈終止多聚核苷酸(blocker)分別與單鏈模板DNA相應(yīng)位置結(jié)合，然后在Bca DNA聚合酶的作用下從引物3'端開始靶序列互補鏈的合成；

步驟2：當(dāng)鏈延伸到blocker序列，鏈延伸終止；

步驟3：在引物結(jié)合模板并開始延伸的同時，延伸產(chǎn)物5'端的RNA部分，與模板形成了DNA/RNA雜合雙鏈，被RNase H酶切割降解，暴露出引物的RNA部分結(jié)合位點；

步驟4：RNA結(jié)合位點暴露后，新的自由引物會通過其RNA部分與模板上相應(yīng)的位置結(jié)合；

步驟5：直到blocker結(jié)合處，置換出一條完整的與靶序列互補的DNA單鏈；同時新引物與模板DNA形成的DNA/RNA雜合雙鏈中的RNA部分再次被RNase H酶切割降解，然后重復(fù)進行引物結(jié)合和鏈置換合成，進入循環(huán)過程；

步驟6：最后反應(yīng)擴增出大量的與靶序列互補的DNA單鏈產(chǎn)物。

2.如權(quán)利要求1所述的酸土脂環(huán)酸芽胞桿菌的分子檢測方法，其特征在于，SPIA反應(yīng)引物為一條3'端是DNA片段5'端是RNA片段的組合引物。

3.如權(quán)利要求1所述的酸土脂環(huán)酸芽胞桿菌的分子檢測方法，其特征在于，SPIA反應(yīng)在進行核酸擴增過程中需要4種脫氧核苷三磷酸(dNTPs)包括：脫氧腺苷三磷酸(dATP)、脫氧胞苷三磷酸(dCTP)、脫氧鳥苷三磷酸(dGTP)、脫氧核糖胸腺嘧啶三磷酸(dTTP)。

4.如權(quán)利要求1所述的酸土脂環(huán)酸芽胞桿菌的分子檢測方法，其特征在于，在SPIA反應(yīng)中，緩沖液選用Bca DNA聚合酶和RNase H酶產(chǎn)品套裝中攜帶的2×Bca DNApolymerasebuffer和5×RNase H buffer反應(yīng)緩沖液。

5.如權(quán)利要求1所述的酸土脂環(huán)酸芽胞桿菌的分子檢測方法，其特征在于，SPIA反應(yīng)的第一個階段為預(yù)變性過程，在200μL離心管中加入混合引物、blocker、dNTPs、MgSO₄、BovineSerumAlbumin、Recombinant RNase Inhibitor、Recombinant RNase Inhibitor、5×RNaseH buffer、2×Bca DNAbuffer、基因組DNA和RNase-free water混合液通過95℃預(yù)變性80s，然后冷卻至常溫，迅速添加Bca DNA聚合酶和RNase H酶，利用實時熒光監(jiān)測儀，設(shè)置反應(yīng)溫度為60℃，時間120min，在試驗過程中可以依據(jù)擴增的熒光信號強度隨時終止反應(yīng)。