[發(fā)明專利]抑制豬流行性腹瀉病毒M基因表達(dá)的shRNA

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010546000.7
• 申請(qǐng)日: 2020-06-16
• 公開（公告）號(hào): CN112063620A
• 公開（公告）日: 2020-12-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王勇;魏泓;李瑤;王首奇;羅力華
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/113
• 分類號(hào): C12N15/113;C12N15/867;C12N7/01;A61K31/713;A61P31/14
• 代理公司: 成都點(diǎn)睛專利代理事務(wù)所(普通合伙) 51232
• 代理人: 李玉興

1.一種用于抑制PEDV M基因表達(dá)的shRNA，其特征在于：其靶點(diǎn)序列為：

5’-GCCAAGGCCACTACAACAATT-3’。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的shRNA，其特征在于所述shRNA的正義鏈或反義鏈的DNA序列如下所示：

正義鏈：

5’-AAGGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCGCGCCAAGGCCACTACAACAATTTAGTGAAGCCACAGATGTAAATTGTTGTAGTGGCCTTGGCTTGCCTACTGCCTCG-3’；

反義鏈：

5’-CGAGGCAGTAGGCAAGCCAAGGCCACTACAACAATTTACATCTGTGGCTTCACTAAATTGTTGTAGTGGCCTTGGCGCGCTCACTGTCAACAGCAATATACCTT-3’。

3.權(quán)利要求1或2所述的shRNA在制備用于抑制PEDV藥物中的用途。

4.一種重組載體，其特征在于：其含有權(quán)利要求1所述的用于抑制PEDV M基因表達(dá)的shRNA。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種重組載體，其特征在于：所述載體基于miR30骨架構(gòu)建而成。

6.權(quán)利要求4所述的重組載體在制備用于抑制PEDV復(fù)制的藥物中的用途。

7.一種慢病毒，其特征在于：含有權(quán)利要求1所述的用于抑制PEDV M基因表達(dá)的shRNA。

8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種慢病毒，其特征在于：其載體為含miR30骨架的載體。

9.權(quán)利要求7-8任一項(xiàng)所述的慢病毒在制備用于抑制PEDV M基因表達(dá)的藥物中的用途。

10.制備權(quán)利要求6所述的慢病毒的方法，其特征在于包括如下步驟：

a、合成針對(duì)PEDV M基因的shRNA的DNA序列，并添加酶切位點(diǎn)，正義鏈及反義鏈各自的DNA序列如下所示：

正義鏈：

5’-TCGAGAAGGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCGCGCCAAGGCCACTACAACAATTTAGTGAAGCCACAGATGTAAATTGTTGTAGTGGCCTTGGCTTGCCTACTGCCTCGG-3’

反義鏈：

5’-AATTCCGAGGCAGTAGGCAAGCCAAGGCCACTACAACAATTTACATCTGTGGCTTCACTAAATTGTTGTAGTGGCCTTGGCGCGCTCACTGTCAACAGCAATATACCTTC-3’

b、將等量的正義鏈和反義鏈DNA混合，進(jìn)行退火，形成DNA雙鏈，得到shRNA模板；

c、用XhoI和EcoRI雙酶切pPRIME-CMV-Neo-FF3載體，得到線性化載體；

d、將步驟2)中的shRNA模板與步驟3)中線性化的載體進(jìn)行連接，得到重組質(zhì)粒；

e、將上述重組質(zhì)粒同pMD2.G和psPAX2通過lipofectamin2000共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，通過病毒空斑純化，包裝成完整病毒顆粒并收集。