[發(fā)明專利]一種增強(qiáng)微生物固氮能力的人工非編碼RNA模塊

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010545585.0
• 申請(qǐng)日: 2020-06-16
• 公開（公告）號(hào): CN111926008B
• 公開（公告）日: 2022-06-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 林敏;戰(zhàn)崳華;燕永亮;柯秀彬
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所
• 主分類號(hào): C12N15/113
• 分類號(hào): C12N15/113;C12N15/78;C12N15/74;C12N1/21;C12R1/38;C12R1/22;C12R1/065
• 代理公司: 北京海虹嘉誠(chéng)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11129
• 代理人: 張濤

本發(fā)明涉及利用合成生物學(xué)方法創(chuàng)建的人工非編碼RNA模塊及其在人工固氮體系構(gòu)建中的用途。所述RNA模塊通過(guò)與固氮酶編碼基因nifHDK mRNA的相互作用，增強(qiáng)nifHDK mRNA轉(zhuǎn)錄后的穩(wěn)定性，進(jìn)而提高了底盤微生物的固氮能力。本發(fā)明構(gòu)建了人工RNA模塊的融合表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)入到不同的底盤固氮微生物中。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在固氮條件下，本發(fā)明的人工RNA模塊能夠顯著提高重組工程菌株固氮酶活性。

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種增強(qiáng)微生物固氮能力的人工非編碼RNA模塊及其在固氮合成生物學(xué)中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

生物固氮是固氮微生物特有的一種生理功能，這種功能是在固氮酶的催化作用下進(jìn)行的，受胞內(nèi)能源供應(yīng)和環(huán)境脅迫因子影響較大。為適應(yīng)環(huán)境變化，固氮微生物在進(jìn)化過(guò)程中形成了一套復(fù)雜的調(diào)控系統(tǒng)，固氮細(xì)胞需要表達(dá)和維持足夠的固氮基因(nif)mRNAs分子，才能確保高效固氮酶活。

天然固氮體系由于受環(huán)境影響較大，導(dǎo)致固氮效率低下，從而極大地限制了其在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。因此利用合成生物學(xué)方法，人工設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)化、智能化的信號(hào)響應(yīng)元件及功能模塊，構(gòu)建高效固氮基因回路，在微生物底盤中進(jìn)行適配機(jī)制研究，創(chuàng)制新型人工固氮體系，是提高生物固氮效率，實(shí)現(xiàn)其在農(nóng)業(yè)廣泛應(yīng)用的新策略和新途徑。

非編碼RNA(Non-coding RNA,ncRNA)是一類非常重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)子。其通過(guò)與mRNA堿基配對(duì)，在轉(zhuǎn)錄后水平抑制或是激活靶基因的表達(dá)，進(jìn)而在細(xì)菌不同的代謝調(diào)控過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。在固氮菌中也發(fā)現(xiàn)了多個(gè)ncRNAs可能參與固氮基因的表達(dá)調(diào)控，其中非編碼RNA NfiR和NfiS分別通過(guò)與固氮酶基因nifD和nifK mRNA的相互作用協(xié)同參與固氮酶活的調(diào)控。

因此，人工設(shè)計(jì)ncRNAs，利用其參與固氮酶調(diào)控的作用特性可以構(gòu)建人工高效固氮體系。

發(fā)明內(nèi)容：

本發(fā)明的目的是設(shè)計(jì)與合成一種人工非編碼RNA模塊，用于各種人工高效固氮體系構(gòu)建。

本發(fā)明提供了一種人工非編碼RNA模塊(Artificial Nitrogenase activity-Enhancing non-coding RNA)，命名為AneR，由以下元件構(gòu)成：

(1)含有與固氮酶編碼基因nifHDK mRNA互補(bǔ)配對(duì)區(qū)的人工RNA編碼序列，其核苷酸序列由SEQ ID NO:2所示

(3)啟動(dòng)所述人工RNA編碼基因轉(zhuǎn)錄的σ⁵⁴依賴型人工啟動(dòng)子元件，其核苷酸序列由SEQ ID NO:3所示。

本發(fā)明的人工非編碼RNA模塊AneR提高底盤微生物的固氮能力的原理是：AneR通過(guò)與固氮酶編碼基因nifHDK mRNA的相互作用，增強(qiáng)nifHDK mRNA轉(zhuǎn)錄后的穩(wěn)定性。

本發(fā)明構(gòu)建了該人工RNA模塊的表達(dá)載體pAneR，其表達(dá)受固氮條件誘導(dǎo)表達(dá)的人工啟動(dòng)子控制，將該融合載體分別轉(zhuǎn)至固氮施氏假單胞菌、肺炎克氏桿菌及棕色固氮菌3株固氮微生物底盤中，獲得了3個(gè)具有新型人工固氮回路的重組工程菌株。

實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在固氮條件下，本發(fā)明的人工RNA模塊AneR能夠顯著提高多種重組工程菌株固氮酶活性。

本發(fā)明是通過(guò)以下具體工作得到上述人工RNA功能元件模塊，并證實(shí)其功能：

1、人工RNA模塊AneR的設(shè)計(jì)與合成